液相提高灵敏的方法

生化–多肽-5988-6316EN升温对于反相HPLC分离强疏水肽的影响(B27)Polypeptide流动相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min进样量:100µL(50µg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室温液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x250mm5µm

室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）第1页/共16页第一页，共17页。环保样品: 除草剂 流动相: 52/480.1M乙酸钠/甲醇,pH6 流速: 0.45mL/min 温度: 40℃,90℃ 检测: UV 除草剂:柱温的影响Herbicides:EffectofColumnTemperature1.西玛津2.敌草隆3.扑灭津4.扑灭净5.异丙甲草胺1.Simazine2.Diuron3.Propazine4.Prometryn5.etolachlor液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x150mm,5μm40℃90℃ 提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）第2页/共16页第二页，共17页。生物制药液相色谱柱:Zorbax300StableBond-C3色谱柱尺寸:4.6x150mm,5μm肽类/蛋白质:升温对分离的影响Peptides/Proteins:EffectofElevatedTemperature样品: 多肽 流动相: A=5:95,乙腈:水,0.10%三氟乙酸(V/V%) B=95:5,乙腈:水,0.085%三氟乙酸(V/V%)梯度: 在20min内15-53%,后运行时间12min 流速: l.0mL/min 温度: 室温-60℃ 检测: UV215nm 1.亮氨酸脑啡呔2.血管紧张素II3.核糖核酸酶A4.牛胰岛素5.细胞色素C6.溶菌酶7.肌红蛋白8.碳酸酐酶1.LeucineEnkephalin2.AngiotensinII3.RnaseA4.Insulin(BOV)5.CytochromeC6.Lysozyme7.Myoglobin8.Carbonicanhydrase提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）第3页/共16页第三页，共17页。生物制药液相色谱柱:ZorbaxStableBond-C8色谱柱尺寸:150mm,5μm减小毛细管内径来提高低浓度样品的检测灵敏度ReducingCapillaryIDtoImproveSensitivityforConcentration-LimitedSamples流动相: 60%乙腈/40%水 流速: 内径0.3mm-4uL/min

内径0.5mm-10uL/min

内径1.0mm-50uL/min

内径4.6mm-1.0uL/min 温度: 室温 检测器: UV254nm 样品: 200ng联二苯(100nl) 减小柱径，可增加柱效（提高灵敏度）第4页/共16页第四页，共17页。色谱柱技术–5988-6454EN使用小体积色谱柱对于检测器响应时间的重要性(TE32)液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x15mm3.5µm流动相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C进样量:5µL响应时间:4.0秒响应时间:2.0秒响应时间:1.0秒响应时间:0.5秒响应时间:0.1秒1.尿嘧啶2.乙酰水杨酸3.N-乙酰苯胺1.Uracil2.Acetylsalicylicacid3.Acetanilide缩短检测器响应时间，可增加柱效（提高灵敏度）第5页/共16页第五页，共17页。色谱柱技术：不同硅胶类型比较(TE1)流动相:含0.05%甲醇的二氯甲烷

液相色谱柱toluenebenzanilidephenolbenzylalcoholZorbaxSilSpherisorbZorbaxRx-Sil甲苯N-苯甲酰苯胺苯酚苯甲醇使用高纯硅胶，可增加柱效（提高灵敏度）第6页/共16页第六页，共17页。有机化学–5988-6366ENpH对苯胺取代物分析的影响(ORCH1)流动相25mM磷酸:甲醇=58:42流速:1mL/min22°C液相色谱柱:ZORBAXStableBond-C18色谱柱尺寸:4.6x150mm5µm对位甲氧基苯胺间位苯甲胺3-氨基-苯甲腈对位氯苯胺间位氯苯胺邻位氯苯胺pH:2.5pH:7.0 改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）第7页/共16页第七页，共17页。生化–肽–5988-6293EN三氟乙酸浓度对于反相肽的分离的影响(B10) Peptide流动相:A:水和三氟乙酸B:乙腈和三氟乙酸0-30%B（30min.内）流速:1mL/minUV:254nm进样量:6uL十肽菌素标样S1-S5（疏水性有略微差异）40°C液相色谱柱:ZORBAX300SB-C8色谱柱尺寸:4.6x150mm5µm1.0%三氟乙酸0.05%三氟乙酸0.25%三氟乙酸改变流动相pH，可增加柱效（提高灵敏度）第8页/共16页第八页，共17页。食品分析–5988-6360EN流动相强度对单糖和二糖分离的影响(FD4)流动相:乙腈/水如图流速:1mL/min示差折光检测器液相色谱柱:ZORBAXNH2色谱柱尺寸:4.6x250mm5µm果糖葡糖蔗糖Palatinose海藻糖异麦芽糖乙腈/水70/30

乙腈/水75/25 改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）第9页/共16页第九页，共17页。色谱柱技术–5988-6468EN有机改性剂和pH对于选择性的影响(TE5)流动相:25mM磷酸缓冲液流速:1.0mL/min.22°C液相色谱柱:ZORBAXStableBond-CN色谱柱尺寸:4.6x150mm5µmanisidinem-toluidine4-cl-aniline3-aminobenzonitrile3-cl-aniline2-cl-aniline甲氧基苯胺间位苯甲胺4-氯-苯胺3-氨基苯甲腈3-氯-苯胺2-氯-苯胺42%甲醇：58%缓冲液30%甲醇：70%缓冲液pH2.6pH3.0改变有机相%，可增加柱效（提高灵敏度）第10页/共16页第十页，共17页。色谱柱技术–5988-6453ENZORBAXEclipse系列色谱柱的选择性(TE31)液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-Phenyl色谱柱尺寸:4.6x150mm5µm流动相:甲醇:水=70:30UV:254nm流速:1.0mL/min.室温ZorbaxEclipseXDB-苯基ZorbaxEclipseXDB-C8ZorbaxEclipseXDB-C181.尿嘧啶2.苯酚3.4-氯-硝基苯4.甲苯5.萘1.Uracil2.Phenol3.4-Cl-nitrobenzene4.Toluene5.Naphthalene改变键合相，可增加柱效（提高灵敏度）第11页/共16页第十一页，共17页。生物制药液相色谱柱:ZorbaxExtend-C18色谱柱尺寸:2.1x150mm,5um三氟乙酸和氢氧化铵用于肽类RP-HPLC\ESI-MS分离的选择性比较SelectivityComparisonofTFAandNH4OHforPeptideRP-HPLC\ESI-MSAnalysis流速: 0.25mL/min. 温度: 25℃ 梯度: 5-60%Bin20min. LC/MS: 正离子,ESI-Vf70V,Vcap4.5kV, N2-35psi,12L/min.,300℃ 样品: 4μL(各50ng) 三氟乙酸条件:A-0.1%三氟乙酸水溶液B-0.085%三氟乙酸80%的乙腈溶液NH4OH条件:A-20mMNH4OH水溶液B-20mMNH4OH80%的乙腈溶液改变有机添加剂，可增加柱效（提高灵敏度）第12页/共16页第十二页，共17页。生化–肽–十肽菌素–5988-6299EN酸对于反相肽的分离的影响(B16) decapeptide液相色谱柱:ZORBAX300SB-C8色谱柱尺寸:4.6x150mm5µm十肽菌素S1 十肽菌素S2 十肽菌素S3 十肽菌素S4 十肽菌素S5decapeptideS1 decapeptideS2 decapeptideS3 decapeptideS4 decapeptideS50.1%三氟乙酸0.025MH3PO4改变有机添加剂可增加柱效（提高灵敏度）流动相:A:含相应的酸的水相B:含相应的酸的乙腈0%-30%B（30min.内）进样量:6µL肽标样UV:254nm流速:1mL/min40°C第13页/共16页第十三页，共17页。色谱柱技术–流动相对色谱的影响(TE40)液相色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C8色谱柱尺寸:4.6x50mm3.5µmUV:254nm流速:1mL/min.室温UracilButylparabenNaphthaleneDipropylphthalateAcenaphthene尿嘧啶尼帕尔金丁酯萘二丙基邻苯二甲酸酯苊刻度混合:Dial-a-MixA:水B:甲醇,用泵抽取50%B体积比混合:Vol/Vol250mL水+250mL甲醇,用泵抽取100%混合液定容混合:Mix-to-Mark

250mL甲醇,用水定容至500mL,用泵抽取100%混合液预混合（重量比混合）:Premixed(w/w)

200g甲醇+200g水,用泵抽取100%混合液改变流动相配比方式，可增加柱效（提高灵敏度）第14页/共16页第十四页，共17页。谢谢观看！资料收集：cbjcn1985@163.com