动物垫料中志贺氏菌检测方法-内蒙古

B41DB15内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/XXXXX—XXXX动物垫料中志贺氏菌检测方法MethodfordetectingShigellainanimalbedding点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）XXXX-XX-XX发布 XXXX-XX-XX实施内蒙古自治区市场监督管理局 发布DB15/TXXXXX—XXXX前 言本标准按照 GB/T1.1-2009 给出的规则起草。本标准由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国呼和浩特海关、内蒙古自治区农牧业科学院。本标准主要起草人：赵治国、延涵、盛万里、王海艳、陈林军、崔强、敖威华、李军燕、罗晓平、韩祎陟。IDBXX/XXXXX—XXXX动物垫料中志贺氏菌检测范围本标准规定了动物垫料中志贺氏菌的分离鉴定定性检测方法。本标准适用于动物垫料中志贺氏菌定性检测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法GB19489 实验室 生物安全通用要求GB/T33682 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则SN/T1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2 培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1动物垫料 animalbedding用于吸收动物排泄物，使动物保持舒适生活环境的铺垫物。包括动物笼内非直接与动物机体接触的铺垫物。设备和材料4.1 冰箱：2℃～5℃。4.2 恒温培养箱： 36℃±1℃。4.3 厌氧培养装置 41.5 ℃±1℃。4.4 均质器。4.5 漩涡振荡器。4.6 电子天平：感量 0.1g，0.0001g。4.7 显微镜：10×～100×4.8 全自动微生物生化鉴定系统。4.9 飞行时间质谱仪。4.10 二级生物安全柜。4.11 无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。4.12 无菌滤膜均质袋。4.13 PH计。4.14 无菌培养皿： 15mm×90mm。4.15 无菌试管：18mm×180mm。1DBXX/XXXXX—XXXX4.16 无菌镊子。4.17 无菌剪刀。4.18 无菌勺。4.19 无菌玻片。4.20 无菌棉签。培养基和试剂5.1 志贺氏菌增菌肉汤 -新生霉素：见附录 A.2。5.2 麦康凯（MAC）琼脂：见附录 A.3。5.3 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（ XLD）琼脂：见附录 A.4。5.4 志贺氏菌显色培养基。5.5 三铁塘（TSI）琼脂：见附录 A.5。5.6 营养琼脂：见附录 A.6。5.7 半固体琼脂：见附录 A.7。5.8 葡萄糖胺培养基：见附录 A.8。5.9 尿素琼脂：见附录 A.9。5.10 β-半乳糖苷酶培养基：见附录 A.10。5.11 氨基酸脱羧酶试验培养基：见附录 A.11。5.12 糖发酵管：见附录 A.12。5.13 西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录 A.13。5.14 粘液酸盐培养基：见附录 A.14。5.15 蛋白胨水、靛基质试剂：见附录 A.15。5.16 志贺氏菌生化鉴定试剂盒。检验程序志贺氏菌检验程序见图1。图1志贺氏菌检验程序2DBXX/XXXXX—XXXX操作步骤7.1 采样 采样原则样品采集应遵循随机性、代表性的原则。采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染。 颗粒状或粉末垫料样品对送检样品包装内不同部位样品进行随机多点取样至少 250g，充分混匀后称取 25g颗粒状或粉末状垫料样品，加入 225mL志贺氏菌增菌肉汤，充分振摇或均质 1min～2min，于41.5 ℃±1℃，厌氧培养 16h～20h。 平面垫料样品无菌操作将灭菌规格板（ 5cm 5cm）放在平面垫料表面，用浸有无菌稀释液（磷酸缓冲液或生理盐水）的棉拭子，在规格板内来回均匀涂抹整个方格3次，并随之转动棉拭子，然后用灭菌剪刀剪去棉拭子与手接触的部分，将棉拭子头置入装有25mL无菌稀释液的无菌锥形瓶中，根据样品面积大小重复取样1～4个规格板面积，相应地将棉拭子头置入25mL～100mL的无菌稀释液中，充分振摇制成样品原液（1mL原液对应的样品面积为1cm2）。取25mL样品原液加入225mL志贺氏菌增菌肉汤，充分振摇或均质1min～2min。于41.5℃±1℃，厌氧培养16h～20h。表1不同面积平面类垫料样品采样量样品面积采样量m2cm2规格板数小于0.25（含）2510.25～0.5（含）5020.5～0.75（含）753大于0.7510047.2 分离取增菌后的志贺氏菌增菌肉汤分别划线接种于 XLD琼脂平板和MAC琼脂平板或志贺氏菌显色培养基平板上，于 36℃±1℃培养20h～24h，观察各个平板上生长的菌落形态。宋内氏志贺氏菌的单个菌落直径大于其他志贺氏菌。若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察，则继续培养至 48h在进行观察。志贺氏菌在不同选择性琼