第八章反胶团萃取

第八章反胶团萃取概述反胶团的形成反胶团的理化特性及制备反胶团萃取的原理在分离工艺中的应用概述1.概念反胶团(ReversedMicelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。反胶团的两个特异性功能（1）具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能：（2）在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。反胶团萃取在分离蛋白中应用的优点（1）有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性;(2)分离和浓缩可同时进行，过程简便;（3）能解决蛋白质在非细胞环境中迅速失活的问题；（4）由于构成反胶团的表面活性剂具有细胞破壁功能，所以可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶；（5）反胶团萃取技术的成本低，溶剂可反复使用等。反胶团的构造当向非极性溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，在非极性溶剂中表面活性剂聚集成团，其疏水性的非极性尾部向外，指向非极性溶剂，而极性头向内，与在水相中行成的微胶团方向相反，因而称为反胶团。反胶团体系的分类

1、单一表面活性剂反胶团体系

研究得最多的是阴离子型ＡＯＴ,该体系结构简单和稳定,反胶团体积相对较大,适用于等电点较高的较小相对分子质量蛋白质的分离,其次有ＤＯＬＰＡ(二油基磷酸)。另一类是阳离子表面活性剂,如ＣＴＡＢ(溴代十六烷基三甲铵),ＴＯＭＡＣ（氯化三辛基甲铵）,ＤＡＰ(十二烷基丙酸铵),ＤＤＡＢ(二十二烷基二甲基溴化铵)等。该体系适用于等电点较低的较大相对分子质量蛋白质的分离。而非离子型表面活性剂能构成更大的反胶团,但这类体系容易乳化。一般在使用时无须加入助剂的表面活性剂具有多条中等长度的烷基尾和一个较小的极性头,如ＡＯＴ,ＤＤＡＢ有二条疏水尾,而ＴＯＭＡＣ有三条疏水尾。

2、混合表面活性剂反胶团体系

这是指两种或两种以上表面活性剂构成的体系,一般来说,混合表面活性剂反胶团体系对蛋白质有更高的分离效率。例如将ＡＯＴ与ＤＥＨＰＡ(二-(2-乙基己基)磷酸)构成的混合体系,可萃取相对分子质量较大的牛血红蛋白,萃取率达80%。其他,如ＡＯＴ/ＤＯＬＰＡ,ＡＯＴ/Ｔｗｅｅｎ85体系对蛋白质的萃取能力都优于单一的ＡＯＴ体系。非离子表面活性剂的加入可使反胶团变大,从而可萃取相对分子质量更大的蛋白质。

3、亲和反胶团体系

这是指体系中除了有组成胶团的表面活性剂外,还有具有亲和特性的助剂,它的亲和配基与目标蛋白质有特异的结合能力,往往极少量亲和配基的加入就会使萃取蛋白质的选择性大大提高。例如,以一种三嗪蓝染料ＣＢ(ＣｉｂａｃｒｏｎＢｌｕｅ3ＧＡ)为亲和配基,极少量的加入ＣＴＡＢ体系后,可以萃取原来不被萃取的牛血清白蛋白。

影响反胶团萃取生物分子的主要因素

1水相ｐＨ值的影响

表面活性剂的极性头朝向反胶团内部,使反胶团的内壁带有一定的电荷。而蛋白质是一种两性电解质,水相的ｐＨ值决定了蛋白质分子表面可电离基团的离子化程度,当蛋白质所带的电荷与反胶团内所带的电荷性质相反时,由于静电引力,可使蛋白质于反胶团中。例如:当用阴离子表面活性剂ＡＯＴ构成反胶团时,其内壁带负电荷,若水相的ｐＨ值<蛋白质的等电点ｐＩ,则蛋白质带正电荷,在静电引力的作用下,使蛋白质进入反胶团而实现了萃取。相反,当ｐＨ>ｐＩ时,由于静电斥力,使溶入反胶团的蛋白质反向萃取出来,实现了蛋白质的反萃。若使用的是阳离子表面活性剂,则情况与上相反。因此,水相的ｐＨ值是影响反胶团萃取蛋白质的最主要因素。

影响反胶团萃取生物分子的主要因素

2水相离子强度的影响

水相离子强度的增加产生两方面的影响:

(1)离子强度影响到反胶团内壁静电屏蔽的程度,降低了蛋白质分子与反胶团内壁的静电作用力；

(2)减小了表面活性剂极性头之间的相互斥力,使反胶团变小。这两方面的效应都会使蛋白质的溶解性下降,甚至使已溶解的蛋白质从反胶团中反萃出来。

影响反胶团萃取生物分子的主要因素3助表面活性剂的影响

蛋白质的相对分子质量往往很大,超过几万至几十万,使表面活性剂形成的反胶团的大小不足以包容大的蛋白质,而无法实现萃取。此时,加入一些非离子表面活性剂,使它们插入反胶团的结构中,就可以增大反胶团的尺寸,溶解较大相对分子质量的蛋白质。

影响反胶团萃取生物分子的主要因素4溶剂体系的影响

溶剂的性质,尤其是极性,对反胶团的形成和大小都有影响,常用的溶剂有:烷烃类(正己烷、环己烷、正辛烷、异辛烷、正十二烷等)、四氯化碳、氯仿等等。有时也用添加助溶剂,如醇类(正丁醇等)来调节溶剂体系的极性,改变反胶团的大小,增加蛋白质的溶解度。反胶团的物理化学特性及制备（1）反胶团的临界胶团浓度：将表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团的最小浓度称为临界胶团浓度。（大多数在0.1～1.0mmol/L的范围内。（2）反胶团含水率W：用水和表面活性剂的浓度之比来定义。W越大，反胶团的半径越大。当W＜６～８时，微水相中的水分子被表面活性剂亲水性基团强烈的束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且冰点通常低于0摄氏度。反胶团的制备方法1：注入法——将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性溶剂中去，然后进行搅拌直到形成透明的溶液为止。这种方法的过程较快并可较好的控制反胶团的平均直径和含水量。方法2：相转移法——将酶或蛋白质从主体水相转移到含表面活性剂的非极性有机溶剂中形成反胶团—蛋白质溶液。即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触，在缓慢的搅拌下，一部分蛋白质转入（萃入）有机相。此过程较慢，但最终的体系处于稳定的热力学平衡状态，这种方法可在有机溶剂相中获得较高的蛋白质浓度。方法3：溶解法——对非水溶型蛋白质可用该法。将含有反胶团的有机溶剂与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团也是稳定的，这也说明反胶团“水池”中的水与普通水的性质是有区别的。反胶团萃取原理从宏观上看反胶团萃取，是有机相和水相剂间的分配萃取，和普通的液液萃取在操作上具有相同特征。微观上，是从主体水相向溶解于有机溶剂相中纳米级的、均一且稳定的,分散的反胶团微水相中的分配萃取。从原理上，可当作“液膜”分离操作的一种。萃取进入有机相的生物大分子被表面活性分子所屏蔽，从而避免了与有机溶剂相直接接触而引起的变性，失活。蛋白质的溶解蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有四种可能：(1)为水壳模型

(2)蛋白质中的亲脂部分直接与非极性溶剂的碳氢化合物相接触

(3)蛋白质被吸附在微胶团的“内壁”上

(4)蛋白质被几个微胶团所溶解，微胶团的非极性尾端与蛋白质的亲脂部分直接作用反胶团萃取决定生理活性物质从主体水相萃入反胶团微水相内的分配系数，萃取率取决于分离场，分离目标物质间的相互作用：（1）静电相互作用（2）立体性相互作用（3）疏水性相互作用（4）特异性相互作用酶，蛋白质萃取特性酶，蛋白质等生物大分子的空间尺度与反胶团的大小相接近。因而所有的相互作用关系都很重要。（1）静电相互作用：(a)对于小分子蛋白质(Mr<20000),pH>pI时，蛋白质不能溶入胶团内，但在等电点附近，急速变为可溶。当pH<pI时，即在蛋白质带正电荷的pH范围内，它们几乎完全溶入胶团内。

(b)蛋白质相对分子质量增大到一定程度，即使将pH向酸性一侧偏离pI，萃取率也会降低。（c）相对分子量更大的BSA，全pH范围内几乎都不能萃取（即静电相互作用效果无限小，可忽略不计）（d）降低pH，正电荷量增加，似乎有利于萃取率的提高。这被认为是蛋白质的pH变性所造成的。（e）添加KCL等无机盐，静电性相互作用变弱，萃取率下降。立体性相互作用增大。(2)立体性相互作用：随着蛋白质分子量的增大，蛋白质分子和胶团间的立体性相互作用增加，萃取率有下降趋势。（3）其他的相互作用：主要是疏水性相互作用和特异性相互作用，目前研究不多。

正向胶团(ｎｏｒｍａｌｍｉｃｅｌｌｅ)是表面活性剂分子在极性溶剂,如水中形成的一种亲水基团(头)朝外,而疏水基团(尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。洗涤剂中的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团,其非极性内核可以溶解各种油污。从而达到去污的效果。与此相反,表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核(ｐｏｌａｒｃｏｒｅ)的多分子聚集体(ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ),由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反,因此,称为反胶团。

在分离工艺中的应用反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质,而且在此基础上还可以溶解一些原来不能溶解的物质,即所谓二次加溶原理。例如,反胶团的极性内核在溶解了水后,在内核形成了“水池”

(ｗａｔｅｒｐｏｏｌ),可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物活性物质。由于胶团的屏蔽作用,使这些生物物质不与有机溶剂直接接触,而水池的微环境又保护了生物物质的活性,达到了溶解和分离生物物质的目的。

这种技术既利用了溶剂萃取的优点,又实现了生物物质的有效分离,成为一种新型的生物分离技术。

应用：三种蛋白质的相互分离

利用反胶团的方法萃取分离蛋白质的研究中,采用ＡＯＴ/异辛烷反胶团体系,通过调节水相的ｐＨ和离子强度,分别将α-核糖核酸酶、细胞色素Ｃ和溶菌酶从三者的混合液中分离开来。表8-2为这三种蛋白质的等电点和相对分子质量。

它们的相对分子质量相近,但等电点有一定的差别。在分离工艺中的应用当ｐＨ>某个蛋白质的ｐＩ时,蛋白质带？带负电荷,相反时蛋白质带正电荷。