微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察

微生物实验实验一显微镜的使用及微生物形态观察第一页，共三十三页，2022年，8月28日实验一显微镜的使用及微生物形态观察

一.目的

1.了解普通光学显微镜的构造，学习显微镜的使用方法和保养。（高、低倍镜的使用）

2.观察蓝细菌、霉菌、酵母菌、放线菌的个体形态，学会生物图的绘制。二.实验器材

1.光学显微镜

2.示范片：颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌。第二页，共三十三页，2022年，8月28日三.实验内容(一)显微镜的构造和使用方法1.构造机械部分:镜筒(双筒，两筒间距离可调，上装有目镜）转换器（3孔，装有物镜）载物台（中央圆孔、弹簧夹、移动器）调节器（粗调、细调）镜臂（支撑作用）镜座（上有光源，亮度可调）光学部分：目镜（10×、16×）物镜（低倍镜10×、高倍镜40×、油镜100×）聚光器（内有光圈调节）光源（光量可调）

第三页，共三十三页，2022年，8月28日

显微镜放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数

物镜上的标识：

1.25(0.65、0.25)100(40、10）

160/0.17

↓↓↓↓

数值孔径放大倍数镜筒长盖玻片厚度

数值孔径：N.A.=n﹒sinα/2

n—玻片和物镜之间的折射率。

α—光线最大射入角。

分辨率（最大可分辨距离）＝λ/N.A.

λ—波长

第四页，共三十三页，2022年，8月28日

2.显微镜的使用

低倍镜的使用

（1）双手取出显微镜置于实验台上，接上电源，打开开关，调节合适光量。

（2）转动转换器，将低倍镜移至正下方。调节两目镜镜筒间的距离。

（3）将载玻片放在载物台上夹住，移动观察对象于圆孔正中。

（4）侧视物镜，转动粗调将载物台上移，至载玻片距物镜头约５ｍｍ时停止。

（5）双眼向目镜里观察，同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移，若标本显出但不清晰，可用细调节器调至清晰。若粗调旋转太快，超过焦点没有看到标本，则必须重复（4）、(5)步骤。不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调，以防物镜与载玻片相碰撞，造成损坏。

第五页，共三十三页，2022年，8月28日

高倍镜的使用

在用低倍镜找到观察目标后，若需要进一步放大观察，将其移到视野中央。用转换器将高倍镜移到镜筒下方，将光量调大一点。若标本不清晰，用细调上下转动使之清晰。（此时不再动粗调）

３．显微镜的维护

（１）将载物台降至最低，取下标本片。

（２）将光量调至最小，关上电源。

（３）用镜头纸先檫目镜、物镜，再擦显微镜其它部分。

（４）将显微镜放入镜箱，还原。第六页，共三十三页，2022年，8月28日（二）微生物形态的观察

1.

用低倍镜和高倍镜观察颤藻、曲霉、青霉、酵母菌、放线菌、星藻示范片。

2.

画出微生物形态图，并标明显微镜的放大倍数。10╳10

颤藻第七页，共三十三页，2022年，8月28日实验二活性污泥生物相的观察

一.目的

1.学习测量微生物大小。

2.学习用压滴法制作标本片。

3.观察几种原、后生动物，菌胶团及藻类个体形态。

二.实验器材

1.活性污泥混合液。

2.单胞藻、新月藻、草履虫等示范片。

3.显微镜、载玻片、盖玻片。

4.目测微尺、物测微尺。第八页，共三十三页，2022年，8月28日

三.实验内容1.微生物大小的测定(1)标定目镜测微尺装在目镜上的目测微尺中央刻有等分为100格或更多格的标尺，使用前要用物测微尺标定。物测微尺中央刻有1mm长的标尺，等分为100格，10μm／格。将物测微尺的刻度朝上放在载物台上，用低倍镜找出物测微尺的刻度，移动物测微尺使其第一条线与目测微尺的第一条线重合，顺着刻度线找出另一条重合线。算出低倍镜下目测微尺每格的长度。换高倍镜用同样方法标定出高倍镜下目测微尺每格的长度。第九页，共三十三页，2022年，8月28日测微尺示意图(2)微生物大小的测量

将物测微尺取下，换上标本片，选择适当物镜测量微生物的长度和宽度占目测微尺的格数，再按目测微尺1格的长度算出微生物的长度和宽度。第十页，共三十三页，2022年，8月28日

2.压滴法观察活性污泥中生物相

（1）压滴法制作标本片用滴管取活性污泥混合液一小滴，放在载玻片中央。取一块盖玻片先将一边与混合液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在混合液上。片内不能有气泡。（2）观察活性污泥中生物相先用低倍镜观察活性污泥中菌胶团、原生动物、后生动物。画出所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。第十一页，共三十三页，2022年，8月28日

四.实验结果

1.低、高倍镜下目测微尺每格的长度。

2.画出2~3种污泥中所观察到的生物形态图。标明名称、放大倍数和微生物的大小。

3.画出两种藻类生物形态图，标明名称、放大倍数和微生物的大小。。3.观察几种藻类的个体形态观察几种藻类的个体形态，画出生物形态图，标明名称、放大倍数。第十二页，共三十三页，2022年，8月28日实验三微生物的染色

一.目的

1.学习微生物的染色技术，掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法。

2.学习油镜的操作。第十三页，共三十三页，2022年，8月28日二．染色原理和油镜的工作原理1．油镜工作原理

油镜的放大倍数最大（100），故镜头焦距短，直径小,但所需光照强度却最大。从标本片透过的光线是从玻片进入空气，再进入镜头。由于玻璃和空气的介质密度不同，有些光会因折射或反射而不能进入镜头。物象就显现不清。为了不使通过的光线有所损失，须在油镜与玻片之间加入折射率和玻璃

(n=1.52）相仿的香柏油

(n=1.515)。故而称之为“油镜”。第十四页，共三十三页，2022年，8月28日

2．单染色法：微生物不但个体微小，且无色半透明。要在显微镜下观察清楚，必须染上颜色。微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质：在酸性溶液中结合质子带正电；在碱性溶液中给出质子而带负电。等电点一般在pH=2~5。所以，在中性、碱性或弱酸性溶液中，微生物细胞通常带负电荷。碱性染料在电离时，染色部分是带正电荷的，容易与带负电荷的菌体结合使之着色。经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下很容易观察。第十五页，共三十三页，2022年，8月28日

3．革兰氏染色法：

革兰氏染色法将细菌分为G＋和G-

，这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定。用结晶紫初染后，所有的细菌都染上蓝紫色。碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物，增强了染料与菌体的结合力。用乙醇脱色处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G＋细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，且壁厚、类脂含量低，用乙醇脱色时使细胞壁脱水、网状结构孔径缩小，通透性降低，使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内。虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以在脱色处理时，类脂被乙醇溶解，细胞壁的通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的颜色。第十六页，共三十三页，2022年，8月28日

三．实验器材

1．显微镜、香柏油、接种环、酒精灯等。

2．结晶紫染液、碘液、95%乙醇、沙黄染液。

3．菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌。第十七页，共三十三页，2022年，8月28日四．实验内容

(一)单染色

1．涂片取一块载玻片，用记号笔划分出两区域并做上记号，在两区域中央各滴半滴无菌水，用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中，和匀后涂成薄膜。

2．干燥室温自然干燥或吹干。

3．固定涂面朝上，通过火焰2~3次。

4．染色在涂片薄膜上滴加结晶紫染液，使之覆盖2分钟。

5．水洗傾倒去染液，斜置载玻片，用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗，直至水呈无色为止。

6．干燥室温自然干燥或用吸水纸吸干。第十八页，共三十三页，2022年，8月28日

(二)革兰氏染色

完成单染色的1~6步骤后

7.媒染加媒染剂碘液使之覆盖1分钟，水洗，吸水纸吸干。

8.脱色滴加95%乙醇数滴使之覆盖16秒钟，立即水洗,吸干。

9.复染用沙黄（番红）液复染2分钟，水洗，吸干。

第十九页，共三十三页，2022年，8月28日(二)镜检

先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后，用转换器将物镜转到空挡，在样品区域滴加香柏油，再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中。若不清晰，慢慢转动微调直至清楚。油镜用完后，用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头。再用干的镜头纸檫干镜头。第二十页，共三十三页，2022年，8月28日

五．实验结果

观察两种细菌的形态和颜色，绘出油镜下细菌形态图，说明革兰氏染色的结果。

六．思考题

通过实验，你认为革兰氏染色成功关键是那一步？为了避免假阳性或假阴性出现，在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时，你认为应该怎样做？第二十一页，共三十三页，2022年，8月28日实验四微生物的计数

（显微镜直接计数法）

一．目的

1.了解血球计数板的计数原理，掌握血球计数板的计数方法。

2.观察酵母菌的形态，学习区分酵母菌死活细胞的方法。二.实验器材

显微镜、血球计数板、酵母菌液、美蓝染液、盖玻片。

第二十二页，共三十三页，2022年，8月28日

三．原理

1.血球计数板计数原理血球计数板是一块特制的载玻片，有四条竖槽和一条横槽。横槽两边的平台上各有一个有九个大方格的方格网，中间大方格为计数室：边长为１ｍｍ，深为0.1mm，容积为0.1mm3(10-4ml)。计数室有两种规格：一是分为16个中方格，每中方格中有25个小方格；另一种是分为25个中方格，每中方格有16个小方格。两种都共有400个小方格。第二十三页，共三十三页，2022年，8月28日

计数：

数出5个中方格中的总菌数A，若菌液的稀释倍数为B，则计算公式如下：

(1)25个中方格的计数板计算公式

(2)16个中方格的计数板计算公式第二十四页，共三十三页，2022年，8月28日

2.区分酵母菌死活细胞基本原理美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型是无色。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变成无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的或淡蓝色，而死细胞或代谢作用的衰老细胞则呈蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。第二十五页，共三十三页，2022年，8月28日

四.实验内容

1.酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴别

(1)在载玻片上加半滴美蓝染液，在染液上滴一滴菌液。取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下盖在菌液上。

(2)将标本片放3分钟后，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

第二十六页，共三十三页，2022年，8月28日

2.酵母菌液的计数

(1)镜检计数室对计数板进行镜检。若有污物，则用自来水冲洗，用电吹风吹干后才能进行计数。

(2)加样品

在血球计数板上盖上盖玻片,用滴管将摇匀的酵母菌液由盖玻片边的小槽滴一小滴,菌液会自动进入计数室，静置5分钟。

(3)计数将血球计数板置于载物台上，先用低倍镜找到计数室的位置，再换高倍镜计数。每计数室计5个中格（四角和中间）。计数原则：计上不计下，计左不计右。芽体占母细胞一半时算一个。

(4)清洗血球计数板

计数后将血球计数板用自来水冲洗干净，勿用硬物刷，吹干后镜检。若不干净，则必须重复洗涤干净为止。第二十七页，共三十三页，2022年，8月28日

五.结果记录

1.2.酵母菌死活细胞的比例？六.思考题用此法计数的结果是活菌体还是死、活菌体的总和？第二十八页，共三十三页，2022年，8月28日实验五活性污泥不同微生物种群的分离培养与鉴别

一.目的

1．掌握配制培养基和制备无菌水的方法。

2.学会玻璃器皿的干热灭菌和培养基高压蒸汽灭菌技术。

3.学习倒平板的方法和两种分离微生物的基本操作技术。

4.学习微生物纯种分离、培养及菌落的观察。第二十九页，共三十三页，2022年，8月28日

二.实验器材1.培养皿、试管、吸管、锥形瓶等。

2.牛皮纸等包扎材料。

3.10%HCl、10%NaOH、精密pH试纸。

4.牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂。

5.高压蒸汽灭菌锅等。

6.活性污泥。

7．接种环、酒精灯、恒温箱(培养箱)等。

8．结晶紫染液。

9.显微镜、载玻片第三十页，共三十三页，2022年，8月28日

三.实验内容

（一）培养基的制备及灭菌1.玻璃器皿的包扎与灭菌（1）六套培养皿一组,用报纸包装。（2）取四支吸量管，在其吸端塞少许棉花后用长报纸条包扎。（3）干热灭菌:上述玻璃器皿在160°C烘箱内2小时。

2.无菌水的制备在3支试管中各装入9ml自来水，塞上硅胶塞,同下述培养基一起用高压蒸汽灭菌。第三十一页，共三十三页