高效液相色谱课件

第四章高效液相色谱法

(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)

一、概述20世纪60年代末70年代初理论：气相色谱的理论技术：高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。

1．高效液相色谱法与经典液相色谱法

优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。二、高效液相色谱仪

主要结构：高压输液系统，进样系统，分离系统检测系统。辅助装置：如梯度淋洗，自动进样数据处理等。

1．高压输液系统

部件组成：储液罐，高压输液泵（核心），过滤器，压力脉动阻尼器⑵高压输液泵

、①要求：流量稳定，无脉动输出压力高流量范围宽耐酸，碱缓冲液腐蚀泵体易于清洗：具有梯度洗脱功能，②高压输液泵的分类

液压隔膜泵气动放大泵注射泵往复柱塞泵B、气动放大泵

C、注射泵

D、往复柱塞泵

往复泵的优点：液缸容积小，易于情况，更换系统，特别适合于梯度淋洗，广泛应用于HPLC，但：有脉动，⑶梯度洗脱装量梯度洗脱，又称：溶剂程序分类：1：低压样度洗脱装置2：高压梯度洗脱装置2．进样系统

高效液相色谱法中对进样技术要求较严。以克服柱外展宽（又称柱外效应）较突出。注射器、进样阀4．检测系统

有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。现将常用的检测器介绍如下:

（l）紫外检测器

最常用：80%的化合物有紫外吸收应用最早，最广灵敏度高对环境温度及流速波动不敏感可适用于梯度洗脱原理：比尔定律

A、紫外检测器的分类与特点单波长式多波长式紫外/可见分光式光电二极管阵列快速扫描式b多波长紫外检测器

光路：与单波长紫外吸收检测器一致，但：光源是氘灯或氢灯波长：200~400nm，灵敏度：比254nm紫外检测器要低。

c紫外—可见分光式检测器

是装有流通池的紫外—可见分光光度计，光源：氘灯和钨灯

光路特点

工作原理

核心：二极管阵列元件是一般由200~1024个组成光波范围：200~600mm每只分辨率为1~2nm光点管越多，分辩率越高如使用211个二极管陈列元件，最快时10ms可是成一次测量。因而每秒可收集20000多个数据可以得到三维图。应用

色谱峰纯度检查。比较光谱法、吸收比法。色谱峰鉴定与标准品或标准光谱比较正常紫外光谱的比较导数紫外光谱的比较三维色谱能提供更多全面的信息。（2）荧光检测法在HPLC种仅次于紫外检测器。灵敏度高。最小检测限比紫外低一个数量级。选择性好，优于紫外。但应用没有紫外广泛。可以衍生化反应工作原理光致发光现象（3）电化学检测法利用电化学固有的灵敏度线性范围106，高灵敏度10-12g，可与荧光相比，具很强的专属性。理论基础

法拉第第一定律在电介过程中，电极上起反应的物质量（W）与通过电介池的电量（Q）成正比。法拉第第二定律各种不同的电介质溶液中，通过相同的电量时，电极上析出的电极产物的当量数相同。（96487库仑）电化学检测种类电流检测器安培检测器，应用最为广泛的一种。

组成：工作电极，参考电极，辅助电极电量检测器

测电量：根据法拉第定律可计算组分的浓度。（4）化学发光检测法：

某些物质，进行化学反应，生成处于激发态的中间体和反应产物。激发态→回→基态→化学发光化学发光的反应条件：反应的自由能应足以生成电子激发态的产物

常用的化学发光剂：光泽精C、鲁米诺（5）示差折光率检测器

通用性检测器。根据化合物的折光率不同。光会偏转。光偏转的程度与样品的浓度成正比。但灵敏度低。温度、梯度、电解质。（6）蒸发光散射检测器：ELSD样品雾化干燥细颗粒激光照射散射（7）常用检测器的比较

表紫外示差荧光安培ELSD类型选通选选通线性2.4×104104103104104最小检出量（g/ml）10-1010-710-1110-910-7能否梯度能不能能不能能对流速不不不敏不对温度不敏不敏不(8)银杏黄酮提取物标准银杏总黄酮银杏总内酯白果酸三、高效液相色谱的固定相和流动相

（－）固定相

分类：以承受高压能力来分类刚性固体、硬胶。刚性固体：以二氧化硅为基质。硬胶：它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中。

分类：

固定相按孔隙深度分类：表面多孔型固定相全多孔型固定相1.表面多孔型固定相基体：实心玻璃珠，表面多孔：多孔活性材料，多孔活性材料：硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、聚酸胺等。特性：厚度薄、孔浅，相对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大，渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平衡，2．全多孔型固定相它由直径为10nm的硅胶微粒凝聚而成。特性：这类固定相由于颗粒很细（5～10μm），孔较浅，传质快，易实现高效、高速。特别适合复杂混合物分离及痕量分析。

（二）流动相

正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：（1）溶剂对于样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。（2）溶剂要与检测器匹配。（3）高纯度。（4）化学稳定性好。(5)低粘度。四、高效液相色谱法的主要类型及选择（－）液一液分配色谱法（LLPC）流动相和固定相：液体。样品类型：极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非离子型的各类化合物。1．分离原理原理：液液萃取相同。

2固定相类型：固定相选择较简单。例如：强极性β，β′一氧二丙睛，中等极性的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。流失问题：化学键合固定相。重大突破。应用最广泛。3/4以上的分离是在化学键合固定

相上进行的。3．流动相基本要求：尽可能不与固定相互溶，流动相与固定相的极性差别越显著越好正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性，它适用于极性化合物的分离。极性小的先流出，极性大的后流出。

反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。

（二）化学键合相色谱法（CBPC）

化学键合相色谱法：简称键合相色谱，采用化学键合相的液相色谱。特点：不易流失，适用于梯度淋洗，表面的官能团可以是各种极性的，特别适用于分离容量因子k值范围宽的样品。适用于种类繁多样品的分离。1．键合固定相类型

载体：

硅胶。(Si一OH)与有机分可成键,一般可分三类（1）疏水基团如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯基等（2）极性基团如氨丙基，氰乙基、醚和醇等。（3）离子交换基团如作为阴离子交换基团的胺基，季镀盐；作为阳离子交换基团的磺酸等.2．键合固定相的制备（l）硅酸酯（≡Si一OR）键合固定相。用醇与硅醇基发生酯化反应：≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20特性：传质特性好,但易水解且受热不稳定，仅适用于不含水或醇的流动相。（2）≡Si－C或Si一N共价键合固定相制备反应如下

特性：共价键健合固定相不易水解，并且热稳定较硅酸酯好。缺点是反应不方便；当使用水溶液时，必须限制PH在4～8范围内。（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）键合固定相制备反应如下：

C18柱的反应与钝化特性：

这类键会固定相具有热稳定好，

不易吸水，

耐有机溶剂的优点。

能在70℃以下，

PH=2～8范围内正常工作，

应用较广泛.13．反相健合相色谱法

固定相：非极性，如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等。流动相：极性较强的溶剂，样品对象：样品范围广。流出程序：优点：柱效高，能获得无拖尾色谱峰的。分离机理疏溶剂作用理论。非极性的烷基键合相“分子毛”，“分子毛”有较强的疏水特性。被分离物质分为：非极性部分与极性部分。一方面，分子中的非极性部分与固定相表面上的疏水烷基产生缔合作用，使它保留在固定相中；这种缔合作用是可逆的。而另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，促使它离开固定相，并减小其保留作用。显然，两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。分离机理疏溶剂作用理论。缔合作用的强度和溶质的色谱保留值取决于三个因素：①溶质分子中非极性部分的总表面积②键合相上烷基的总表面积③洗脱液的表面张力

表面张力大，S与L缔合时释放的能量多，k也大加入电解质，表面张力大，k也大。有机极性溶剂增加，表面张力小，k也小。无机盐增加，表面张力大，k也大。分离机理双保留机理，以下共同贡献：疏溶剂作用亲硅醇基效应

4.正相键合相色谱法

固定相：极性的有机基团，CN、NH2等键合在硅胶表面。流动相：非极性或极性小的溶剂（如烃类）中加入适量的极性溶剂（如氯仿、醇等）。流出程序：极性大，后出；极性小，先出。样品对象：分离极性化合物。异构体。特别适用于分离不同类型的化合物。5.离子性键合相色谱法

固定相；硅胶为基质，键合各种离子交换基团，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等。流动相：缓冲溶液。分离原理：离子交换。离子性化学键合相色谱法优点：①可有效地分离各种类型化合物（非极性、极性和离子型）。②不易流失。③特别适用于梯度淋洗。缺点：不能用酸、碱度过大或存在氧化剂的溶液作流动相的体系。

（三）液一固吸附色谱法(LSAC)

固定相：固体吸附剂。1．分离原理吸附:

X+nSad=Xad+nS

达平衡时,Kad=Kad为吸附平衡常数，Kad值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。Kad值可通过吸附等温线数据求出。

2．固定相

吸附剂：如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。硅胶线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应因此硅胶用得最多。

3流动相

一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。对极性强的试样宜用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来量。ε0越大，表示洗脱剂的极性越强。氧化铝（ε0硅胶=0·77×ε0氧化铝）。(四）离子交换色谱法（IEC）

离子交换原理和液相色谱技术的结合样品对象：离子型化合物如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。1．离子交换原理待测离子对固定相（离子交换树脂）亲和力的差别来实现分离的。阳离子交换：阴离子交换：

一般形式：R一A＋B＝R－B＋A达平衡时，平衡常数（离子交换反应的选择系数）：

KB/A=[A][B]r/[B][A]r，式中[A]r，[B]r分别代表树脂相中洗脱剂离子（A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表它们在溶液中的浓度。KB/A越大，说明B离子交换能力越大，越易保留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水合离子半径越小，KB/A值就越大。

磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+二价离子的顺序为：Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+对于季铵型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-

＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－2．固定相

基质有三大类：

合成树脂（聚苯乙烯）

纤维素

硅胶。

离子交换剂：阳离子和阴离子。

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常用的离子交换剂固定相大致可分以下几种：（l）多孔型离子交换树脂聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联聚合物。（2）薄膜型离子交换树脂

在直径约对30μm的固体惰性核上，凝聚1～2μm厚的树脂层。（3）表面多孔型离子交换树脂在固体惰性核上，覆盖一层微球硅胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。（4）离子交换键合固定相化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。3．流动相

缓冲溶液。选择：离子种类、浓度和pH值。

阴离子交换树脂，各种阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-所以用柠檬酸离子洗脱要比用氟离子快。阳离子的滞留次序大为：Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十但差别不如阴离子明显。关于pH值的影响，要视不同情况而定。只要电离度增大，就会使样品的保留增大。

（五）离子色谱法（IC）

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子分析和应用受到限制。例如：无机离子。1975年Small等人提出后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。离子色谱。样品为阳离子，无机酸作流动相，抑制柱为阴离子交换剂。试样→阳离子交换剂的分离→抑制柱→发生两个重要反应：R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-由反应可见：一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，OH-淌度为Cl-的2．6倍，提高了电导检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。抑制柱要定期再生通过抑制柱后峰会加宽，降低了分离度。Frits等人采用了电导率极低的溶液，例如10-4～5×10-4mol·L-1苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。（六）离子对色谱法（IPC）

离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。1．离子对色谱法原理反离子加到流动相或固定相中，结合形成离子对。

色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种机理：离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。现以离子对形成机理说明之。色谱机理假如有一离子对色谱体系，固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，离子对生成反应式A-+B+＝A-B+离子对化合物A-B+具有疏水性，被非极性固定相（有机相）提取。如组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同形成的离子对疏水性质不同，各组分离子在固定相中滞留时间不同，因而出峰先后不同。——基本原理。

2．键合相反相离子对色谱法如：固定相采用非极性的疏水键合相［ODS等］，流动相为加有平衡离子（反离子B+水）极性溶液。根据离子对生成反应式，