基因工程考试试卷试题

—名词讲解

基因工程

精选文档1、限制与修饰系统：限制酶的生物学功能一般被以为是用来保护宿主细胞不受外源 DNA的感染，可讲解外来 DNA，进而阻挡其复制和整合到细胞中。一般来说，与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶，或许说是甲基化酶，能保护DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶构成限制与修饰系统。2、各样限制与修饰系统的比较区分位点切割位点简答

Ⅱ型4~6bp，大多为回文序列在区分位点中或凑近区分位点

Ⅰ型二分非对称100bp

Ⅲ型5~7bp非对称区分位点下游24~26bpStaractivity

？简述Staractivity

的影响要素及战胜方法？答：在极端非标准条件下，限制酶能切割与区分序列相像的序列，这个转变的特色称为星星活性。惹起星星活性的的要素： ①高甘油浓度〔>5%〕；②酶过度〔>100U/μl〕；③低离子强度〔<25mmol/L〕；④高pH(>8.0) ；⑤有机溶剂如DMSO〔二甲基亚砜〕离子Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+ 取代Mg2+。星星活性的抑制举措：①削减酶的用量，防止过度酶切，削减甘油浓度；②保证反响系统中无有机溶剂或乙100～150mM〔在不抑制酶活性的前提下〕pH7.0Mg2+作为二价阳离子。试答复影响限制性内切核酸酶切割效率的要素？

〔影响酶活性的要素？〕答：外因：反响条件、底物纯度〔能否有杂质、能否有盐离子和苯酚的污染〕的选择、反响时间的长短内因：星星活性、底物甲基化、底物的构象3DNA尾端长度对酶切割的影响

、何时加酶、操作能否适合，反响系统答：限制酶切割DNA时，对区分序列两头的非区分序列有长度要求，也就是说在区分序列两头肯定要有必定数目的核苷酸，不然限制酶将难以发挥切割活性。在设计 PCR引物时，假设要在尾端引入一个酶切位点，为保证能够顺当切割扩增的PCR产物，应在设计的引物尾端加上能够知足要求的碱基数目。一般需加4、何为载体？一个抱负的载体应具备那些特色？

3～4个碱基对。DNA或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备：①在宿主细胞内肯定能够自主复制〔具备复制原点〕；②肯定具备适合的酶切位点，供外源选择；④其余：有必定的拷贝数，便于制备。

DNA片段插入，同时不影响其复制；③有必定的选择标志，用于5抗性基因〔Resistant gene〕是当前使用的最广泛的选择标志，

常用的抗生素抗性有哪几种？并举两例说明其原理？答：氨苄青霉素抗性基因〔ampr〕、四环素抗性基因〔tetr〕、氯霉素抗性基因〔Cmr〕、卡那霉素和霉素抗性基因〔kanr,neor〕以及琥珀突变抑制基因 supF 。⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成

，与相关的酶联合，抑制转肽反响并抑制其活性。氨苄青霉素抗性

Ampr编码一个酶，可分泌进入细胞的周质区，并催化

β-内酰胺环水解，进而排解氨苄青霉素的毒性。30STetr399个氨基酸构成的膜联合蛋白，可阻挡四环素进入细胞。6.何为α-互补？怎样利用α-DNA的重组质粒？答：α-互补指lacZ 基因上缺失近操控基因区段的突变体与带有完好的近操控基因区段的

β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。

α-互补是鉴于在两个不一样的缺点

β－半乳糖苷酶之间可实现功能互补而成立的。实现

α-互补主要有两局部构成：

LacZ△M15，放在F 质粒或染色体上，随宿主传代； LacZ”

，放在载体上，作为选择标志，LacZ”

中插入一个片断后，将不行防止地以致产生无

α-互补力量的β－半乳糖苷酶片断。在引诱物

IPTG 和X-gal〔同时可作为生色剂〕的作用下，含重组质粒的菌落不行以产生有活性的gal ，表达白色，而含非重组质粒的菌落则表达兰色。以此到达选择的目的。

β－半乳糖苷酶，不行以分解 X-1/6.2/6精选文档7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态 Lyticgrowth 和溶原状态Lysogenicstate 两种循环的分化及其调理过程？答：裂解生长状态是λλ菌

溶原状态为λ体基因组DNA经过位点专一性重组整合到宿主染色体

DNA中随宿主的生殖传到子代细胞。调理过程：

由感染复数和细胞的养分状态打算的，感染复数越高，养分状态越差，则溶源化的频次就越高。溶源现象的生化媒介可能是3”--5”cAMP ，它在细胞内的浓度会随养分条件的变化而转变，当细胞在富养分培育基中生长时，有益于裂解生长；在缺乏cAMP的突变细胞中，更有益于裂解生长此外一个重要的调理要素是噬菌体的

cAMP的浓度较低，CDNACⅡ蛋白促使溶CCCintDNA与染色体整合，朝着溶源态生长。9cDNA文库的建立：将来自真核生物的⑴细胞总RNAmRNA的分别

mRNA体外反转录成cDNA，与载体连结并转变大肠杆菌的过程。⑵第一链合成：由

mRNAcDNA的过程为反转录，由反转录酶催化。⑶其次链合成：①自己引物合成法 ②置换合成法 ③指引合成法 ④引物—连接头合成法⑷双链cDNA里连结到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中生殖10、文库质量检测答：文库质量是由文库所含克隆的数目、均匀插入片段的长度、插入效率、基因组掩盖度和掩盖倍数等要素打算。克隆数越多、均匀插入片段的长度越长、插入效率和基因组掩盖度越高，文库质量越好。克隆数目能够经过屡次转变累46倍掩盖率。11、基因掩盖倍数的估量方法答：有两种，一：用公式计算 基因组掩盖倍数=均匀插入片段的长度ⅹ克隆数 /基因组DNA长度二：联合基因掩盖度检测来估量。 基因组掩盖度是指问苦处克隆掩盖基因组的范围。即选择必定数目的单拷贝基因作探针来选择文库。每个探针选择的克隆数目，即为该基因位点的掩盖倍数。12、讲解并计算N=ln(1-P)/ln(1-f)式中N：代表一个基因组文库所包括重组克隆个数f ：表示重组克隆均匀插入片段的长度和基因组

P：代表所期望的目的基因在文库中消灭的概率DNA长度的比值计算：大肠杆菌基因组大小约

4.6mbP=99%，均匀插入片段大小为

20kb，f=20kb/4600kb,则N=1057.20kb的大肠杆菌基因组文库中选择到随便一个感兴趣的基因的概率达99%，该基因文库起码应包括1057个重组克隆。选择适合的载系统统和挑去必定的阳性克隆是建立基因组文库时第一考虑的问题。1cDNA文库的均一化办理

阐述题两条门路：基因组DNA饱和杂交法和基因组DNA饱和杂交法⑴基因组DNA饱和杂交法原理：利用不一样表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对全都的特色，能够对

cDNA文库进展均一化办理步骤①将基因组DNA用限制性内切酶消化固定，消化后的基因组DNA扁形为相对较短的单链且最大可能的掩盖基因组。②分别纯化独立cDNA文库的混淆质粒③文库cDNA与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固定住相应的特长：应用简洁、没有一仪器上的限制

cDNA，并将它洗脱从头转变受体菌。弊端：由于基因组DNA相对很简单，很难猎取掩盖基因组的单链 DNA片段，以致基因丢掉；在基因组DNA与文库DNA杂交的过程中，文库DNA自己杂交的速度会很快，以致基因丢掉。⑵基因组DNA饱和杂交法DNA在加热变后再复性形成双链

DNA的速度依据二次复性动力学原理。即与组分中的单链 DNA浓度相关，

cDNA文库中高丰度的cDNA复性所需要的时间短，低丰度的

cDNA复性所需的时.3/6间长。经过对复性时间的掌握，能够使高丰度的

精选文档cDNA复性成双链状态，低丰度的 cDNA保持单链状态。利用羟

cDNA分开，再用猎取的单链 cDNA转变宿主细菌，即可猎取均一化

cDNA文库。特长：几乎不会以致文库中 cDNA的丢掉；均一化成效明显弊端：基因组DNA饱和杂交法成功率高，而基因组 DNA饱和杂交法在参数掌握上存在着比很多的要素。2、扣除杂交cDNA文库原理：利用分子杂交原理，去除非差异表达基因的

cDNA，保存差异表达的基因的

cDNA用于制备文库。待测样本tester:

待测样本的总cDNAdriver:

表达谱背景全都但不含目的基因的总

cDNA。tester 与过度的driver

杂交，用特定方法将两者共同表达的

cDNA去除。如：抑制性扣除杂交(suppressionsubtractivehybridization,SSH)原理：含目的基因的cDNA称为供体tester ，不含目的基因的cDNA称为驱动driver 。它们是由对应的mDNA组分在体外独立反转录成的。同时利用区分4个碱基的限制性内切酶为二，分别接上二种不一样的接头。

RsaΙcDNA消化成平尾端小片段。将供体一分第一轮杂交：过度的驱动cDNA分别与带有2中不一样接头的供体cDNA杂交，在2个独立的杂交系统中，供体与驱动cDNA4种种类的cDNAa、供体中既没有与供体杂交，也没有与驱动杂交的b、供体中自己杂交的 cDNA分子。c、供体与驱动中共同表达的基因杂交形成的双链d、驱动中自己杂交和不行以自己或与供体杂交的

cDNA分子。分子。cDNA分子。其次轮杂交：将第一轮杂交的两个系统混淆，再参加过度的驱动 cDNA，进入其次轮杂交。杂交结果进一步形成了 a、b、c、d。也形成了e〔带不一样接头a形成的〕。将其次轮杂交的产物进展尾端补齐，再进展两轮 PCR扩增。在扩增过程中，由于a、d两头没有引物联合位点而不行以再扩增。b两头带有同样的接头序列，形成蜗柄构造，不行以进展指数扩增。c 只有一个引物接头，只好被线性扩增。只有 e是均一化的，差异表达的基因。用巢式引物进展其次轮建扣除杂交cDNA文库

PCR，降低PCA产物的背景，富集差异的基因。最终将

PCR产物用T/A克隆载体进展克隆构3、烟草酸性焦磷酸酶法建立全长原理：烟草酸性焦磷酸酶〔

cDNA文库TAP〕，能特异性地区分真核生物mRNA的5’端帽子构造并将其去除。暴露出切口 5’端的磷酸基团，可在该切口处连结一段特异的接头来指引

cDNA其次链的合成。①在反转录合成第一链前对

mRNA进展去磷酸化办理，使不完好的

mRNA5’磷酸基团被去掉。②在反响中参加

TAP，特地的去掉完好mRNA5’尾端的帽子构造，暴露出

5’磷酸基团。T4RNA连结酶的作用下，能够在

5’端连结上一段特异的

RNA接头，不完好的mRNA分子中，由于缺乏磷酸基团而不行以接上接头。所以，只有增加了接头的全长合成的cDNA都是全长的cDNA。

mRNA分子才能在接头指引下合成其次链

cDNA。理论上讲，用此法4、酵母双杂交系统 〔绘图〕P207简称双杂交系统〔two-hybriclsystem〕也叫相互作用圈套〔interactiontrap〕是依据真核生物转录调控的特色，创立的一种体内判定基因的方法。其选择的基因不是“探针”的直接编码产物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即选择与始终基因产物发生相互作用的蛋白的编码基因。很多真核生物转录激活因子有两个功能地区，一是DNA联合构造域〔DNAbindingdomain,BD〕，DNA序列的特定位点即上游激活序列联合；二是转录激活构造域〔

activationdomain,AD 〕,关心RNA聚合酶‖复合体激活上游激活序列下游基因的转录。将 X与BD交融，蛋白Y与AD交融，将它们导入酵母细胞中表达，假设 X和Y相互作用，则会以致BDAD在空间上凑近，形成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。.4/65、根癌农杆菌介导法〔绘图〕

精选文档原理：根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒〔 tumorinducingplasmid 〕,简称Ti 质粒，当根癌农杆菌感染植物时，TiT-DNADNA片段进入宿主细胞并插入基因组中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进展转录和翻译，其表达产物可引发植物产生肿瘤。根癌农杆菌Ti质粒的基因构造主要分为〔virulenceregion

区〔transferredDNAregion〕、

〕、Vir 区Con区〔regionencodingconjugation 〕和Ori区〔originofreplication 〕4个区段。T-DNA区称为转移DNA区。即根癌农杆菌侵染植物时转移到植物基因族中的一段

DNA序列，该序列上的基因与肿瘤的形成相关。 Vir 区与T-DNA区相邻，该基因可激活

T-DNA的专一，使植物致瘤，故称毒性区。Con 区段上存在与细菌联合转移相关的基因，调控Ti质粒在根癌农杆菌中的转移，故称为过程：①农杆菌对受体的区分②农杆菌附着到受体细胞③引诱和启动毒性区基因表达

联合转移编码区。Ori区主要调控Ti质粒的自我复制，故称之

为复制开端区。④近似联合孔复合物的合成和装置T-DNA的加工和转运6、一元载体的建立的基根源理Ti质粒上T-DNA中的致瘤基因全部去掉，使其丧失对植物的致瘤性

。仅保存其双侧界限与 T-DNA正确转移所必25个碱基序列，故这类载体又称

②由于根癌农杆菌的Ti质粒比较大，难以进展体外遗传操作 ，需要引入一个较小的中间载体，将欲转变的目的基因建立于中间载体上。③在卸甲载体T-DNA区中删除致癌基因的位点插入一段与中间载体同源的质粒序列。④将中间载体转移到含有卸甲载体的根癌农杆菌中。

由于卸甲载体的 T-DNA与中间载体拥有同源序列，故可在根癌农杆菌中发生同源重组。

将中间载体整合到卸甲载体的

T-DNA区，并与卸甲质粒一同复制。⑤为发生整合的中间载体因其没有在根瘤农杆菌中的复制元件，会自行消逝。⑥依据中间载体上所携带的抗性基因进展抗性选择，即可。7、二元载体的建立的基根源理原理：关于一元载体来说，由于其 T-DNA与Vir区是在同一载体上，

故又称顺式载体。而事实上，T-DNA与Vir 区完好没有必需必定要建立到同一载体。当它们处于不一样载体上时，

Vir 区经过反式作用照旧能够使

T-DNA发生转移。

Ti质粒，一个称为微型

Ti质粒，一个称为关心

Ti质粒。此中微型Ti 质粒缺失了Vir 区，其T-DNA也进展了卸甲办理，同时引入多个酶切位点，便利外源基因的插入，其余，拥有 广谱的复制原件，可同时在大肠杆菌和根癌农杆菌中生计。经过改造的微型

Ti质粒相当小，可像一般质粒同样进展遗传操作。关心Ti质粒相对较大，只去除了 T-DNA，可激活微型Ti质粒上的T-DNA发生转移。

T-DNA中含有中间载体，它们会伴同外源目的基因一同被转入植物细胞内，而二元载体的不会带入大批无用的冗长

DNA序列。所以外源基因的转变效率高于一元载体 。8、Sanger 双脱氧链停顿法〔绘图〕 P158双脱氧链停顿测序法使用双脱氧核苷酸，它与脱氧核苷酸的主要不一样在于：双脱氧核苷酸分子中脱氧核糖的置的羟基〔—OH〕缺失。扩增时，在DNA聚合酶的作用下，其5’地点的磷酸基团与上位脱氧核苷酸的

3’位3’地点的羟基联合，可是，由于其自己

3’地点的羟基缺失，以致下位的

5’地点的磷酸基没法与之联合。即，双脱氧核苷酸整合到正在合成的

DNA链中，该DNA的合成就到此停顿。9、载体的分类按功能分：克隆载体：〔主要用于扩增或保存 DNA片段，是最简洁的载体。拥有强盛的包装力量〕表达载体：〔带有目标细胞识其余启动子〕其余载体：〔整合载体、穿越载体等〕.5/6按根源分：质粒〔细菌等原核生物染