黄酮类化合物乳腺癌耐药蛋白BCRP-PPT报告

Characterizationof3-methoxyflavonesfortheirinteractionwithABCG2assuggestedbyATPaseactivity研究目的：希望能够从几种化合物中找到ABCG2的一些非常有效的，低毒性的黄酮类抑制剂。

研究思路：选出几种化合物证明有抑制作用

确定这种抑制作用

确定抑制作用类型得出结论BCRP/ABCG2:BreastCancerResistanceProteinMDCKcellsandMDCKBCRPcellsHoechst33342pheophorbideAHighFive™insectcellsAcMNPV（苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒/杆状病毒）Fluorescencespectraofcompounds

1–7

andHoechst33342theHoechst33342andpheophorbideAassayAccumulationstudiesbyconfocalmicroscopyAccumulationmeasurementusingamicroplatereaderProteinexpressionininsectcellsSDSgel-electrophoresisandwesternblotanalysisATPaseactivitymeasurementsMTTcytotoxicityassayInhibitionkineticsmethodsFluorescencespectraof3-methoxyflavones1–7andHoechst33342Resultsanddiscussion

InvestigationofselectedcompoundsfortheiraccumulationinABCG2overexpressingcellsMeasurementofaccumulationof3-methoxyflavones.ThefluorescenceofaccumulatedcompoundsinMDCKBCRPandMDCKsensitivecellswasmeasured.Cellswithoutcompoundwereusedasnegativecontrol.(NS:not

significant，*p<0.05,**p<0.01,t-testofsignificance).#Compound6showedverylowfluorescence.ABCG2membranepreparationandATPaseassayCharacterizationofHighFivemembranesfortheoverexpressionofABCG2.

Lane1showspositivecontrolofABCG2,lane2showsmembraneproteinpreparationsofHighFiveinsectcellsinfectedwithABCG2baculovirusandlane3showsnegativecontrolofHighFiveinsectcellmembranepreparationsnotinfectedwithABCG2baculovirus.2.1ABCG2membranepreparation

2.2ATPaseassayATPaseactivityofcompounds1–7measuredusingHighFiveinsectcellmembranes.ATPaseactivityofallcompoundswasmeasuredat25

μMconcentration.Prazosinandquercetin

wereusedaspositivecontrols,whiletheinhibitoryeffectofKo143

wasusedasnegativecontrol.4.Concentrationresponsecurvesforcompound4intheATPaseassay.由以前的文献可知，底物与转运蛋白有两个结合位点，其中一个结合位点对底物有高的亲和力，并且是活跃的位点，另一种位点对底物具有低亲和力且是抑制位点。如果两个结合位点的亲和力是彼此接近的，会形成一个钟形曲线。如果活性结合位点的亲和力比抑制位点的高得多，则会形成米氏曲线。3.Cellviabilityassay3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcellsClosedtriangle:MDCKBCRPcellsclosedcircle:MDCKsensitivecellsopencircle:dilutionsolvent实验中所用到的最高浓度是100微摩尔，图示，在这个浓度下，敏感细胞和耐药细胞中都没有显示出细胞活性的显著下降。可见，化合物4是低毒性的。3.1CytotoxicityofselectedtestcompoundsinMDCKcells通常，有细胞毒性的ABCG2底物，对敏感和耐药细胞的细胞毒性是有差异的。耐药细胞会把底物排出，同时也就降低了底物对细胞的毒性。如果测试化合物有细胞毒性，并显示在耐药细胞中比在敏感细胞中有较低的细胞毒性，我们可以得出结论，这些化合物由ABCG2排出，导致更低的细胞内积累和较低的毒性。由于其低毒性，没有观察到在敏感和抗性细胞中细胞毒性的显著差异。3.2EffectoftestcompoundsoncytotoxicityofSN-38inABCG2overexpressingcells.ABCG2的毒性底物在过表达ABCG2的细胞中，由于被转运蛋白排出，所以毒性会下降，如果在本身存在ABCG2的细胞毒性底物时，再加入化合物4，就可以看出化合物4对这些底物的耐药性的影响，或者说化合物4是否能逆转底物的耐药性。实心方块：没有抑制剂的耐药细胞；实心圈：敏感细胞。空心三角形：浓度为1μM的化合物4空心圆：2.2μM。相比于不加化合物4，加入不同浓度的化合物4后，曲线有明显的左移，且浓度越大，越接近敏感细胞。化合物4逆转了底物的耐药性。Now………功能实验的结果显示1,3,4,6，这几个化合物是ABCG2的良好的抑制剂过表达ABCG2的胞内聚集实验表明，这些化合物都可能是转运蛋白的底物（除5，但化合物5的抑制作用并不好）酶活性实验结果，同样是说明了这几个化合物可能是转运蛋白的底物细胞活性实验，说明这化合物4是低毒的，但同时却能降低SN-38的毒性。是底物也是抑制剂。非竞争抑制非竞争性抑制的特点：⑴非竞争性抑制剂的化学结构不一定与底物的分子结构类似；⑵底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；⑶抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；⑷动力学参数：Km值不变，Vm值降低。5.InhibitionkineticsInteractionofcompound4withpheophorbideA.Interactionofcompound4withHoechst33342.

空心圆：对照组；实心圆：0.0562μM，空心方块：0.1μM；实心正方形：0.178

μM；空心三角：0.316μM；实心三角形：0.562

μM。空心圆：对照组；实心圆：0.1μM；空心方块：0.316

μM；实心正方形：0.562

μM；空三角：1.0

μM；实心三角形：1.78

μM。在这个研究中，我们使用不同浓度的化合物4，分别作用于赫斯特33342或脱镁叶绿A。改变底物的浓度，观察他们之间的作用关系。由图可见，两个实验的结果都显示他们是非竞争的关系。也就是说底物的存在并不影响抑制剂的抑制作用，底物和抑制剂作用在不同的位点。1.Fromthecurrentstudy,wecanconcludethatallselectcompoundsexceptcompound5and6seemtobesubstratesofABCG2.Conclusions3.Incellviabilityassay,compound4wasfoundtohavelowtoxicityeveninthehighermicro-molarrangeandwasabletoreversethedrugresistanceforSN-38inABCG2overexpressingcells.Inenzymekineticstudiesofcompound4,wewereabletoshowanon-competitiveinteractionofcompound4towardsHoechst33342aswellastowardspheophorbideA.从这些研究结果表明尽管3-甲氧基黄酮类化合物是ABCG2的良好