色谱、质谱、联用

液相色谱、质谱、联用仪的发展及应用主要内容色谱法的发展质谱法的发展液相色谱法及液质联用化学学科合成化学分析化学理论与计算化学仪器分析现代分离方法电化学分析光谱分析CE(毛细管电泳分离）LCGC经典色谱法Chromatography1905年俄国植物学家M.G.茨维特柱色谱纸色谱薄层色谱一、色谱法的发展MichaelTswett(1872-1919),aRussianbotanist,discoveredthebasicprinciplesofcolumnchromatography.Heseparatedplantpigmentsbyelutingamixtureofthepigmentsonacolumnofcalciumcarbonate.Thevariouspigmentsseparatedintocoloredbands;hencethenamechromatography.

石油醚现代色谱法1952年气相色谱分析法NationalInstituteforMedicalResearchLondon,UnitedKingdomMartinAJPRowettResearchInstitute

Bucksburn(Scotland),UnitedKingdomSyngeRLM色谱法的发展历史年代发明者发明的色谱方法或重要应用1906Tswett用碳酸钙作吸附剂分离植物色素。最先提出色谱概念1931Kuhn,Lederer用氧化铝和碳酸钙分离a-、b-和g-胡萝卜素1938Izmailov,Shraiber最先使用薄层色谱法1938Taylor,Uray用离子交换色谱法分离了锂和钾的同位素1941Martin,Synge提出色谱塔板理论；发明液-液分配色谱；预言了气体可作为流动相（即气相色谱）1944Consden等发明了纸色谱1949Macllean氧化铝中加淀粉黏合剂制作薄层板使薄层色谱进入实用阶段1952Martin,James从理论和实践方面完善了气-液分配色谱法1956VanDeemter等提出色谱速率理论，并应用于气相色谱1957

基于离子交换色谱的氨基酸分析专用仪器问世1958Golay发明毛细管柱气相色谱1959Porath,Flodin发表凝胶过滤色谱的报告1964Moore发明凝胶渗透色谱1965Giddings发展了色谱理论，为色谱学的发展奠定了理论基础1975Small发明了以离子交换剂为固定相、强电解质为流动相，采用抑制型电导检测的新型离子色谱法1981Jorgenson等创立了毛细管电泳法色谱法起过关键作用的诺贝尔奖研究工作年代获奖学科获奖研究工作1937化学类胡萝卜素化学，维生素A和B1938化学类胡萝卜素化学1939化学聚甲烯和高萜烯化学1950生理学、医学性激素化学及其分离、肾皮素化学及其分离1951化学超铀元素的发现1955化学脑下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素1958化学胰岛素的结构1961化学光合作用时发生的化学反应的确认1970生理学、医学关于神经元触处迁移物质的研究1970化学糖核苷酸的发现及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化学核糖核酸化学酶结构的研究1972生理学、医学抗体结构的研究色谱法分类按固定相的形态分类柱色谱：填充柱、整体柱、毛细管或开管柱平面色谱：薄层色谱和纸色谱按色谱动力学过程分类淋洗色谱法置换色谱法:一种非线性色谱技术，是指样品输入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱。迎头色谱法:将试样连续地通过色谱柱，吸附或溶解最弱的组分，首先以纯物质状态流出色谱柱，然后顺次流出的是次弱组分和第一流出组分的混合物，依次类推，从而实现混合物分离的色谱法。按两相的物理形态、分离机理等分类色谱法分类色谱法特点及与其它分离分析方法比较分离效率高；分析速度快；检测灵敏度高；样品用量少；选择性好；多组分同时分析；易于自动化；定性能力较差。色谱法的优缺点：与化学分析比较（1）不受化学性质限制，是一种分离分析方法。（2）化学分析本身不具备分离功能。（3）化学分析一般不适用于分析多组分的混合物。（4）化学分析定量方法简易；色谱法定量测定较复杂。

色谱法特点及与其他分离分析方法比较（1）色谱、精馏与萃取：平衡分离方法。（2）色谱法与精馏、萃取比较：速度快、效率、选择性高。（3）精馏不能分离沸点相同的组分，萃取不能分离在溶剂中溶解度相同的组分；色谱法可分离沸点、溶解度相同的组分，可分离物理、化学性质相近、其他分离方法不能或难以分离的组分。

（4）色谱法每次处理样品量少。与精馏、萃取比较与光谱、质谱方法比较（1）光谱、质谱用于物质定性鉴定，色谱法定性功能差。（2）色谱法最主要特点是适于多组分复杂混合物分离分析。（3）色谱仪价格比分子光谱、质谱仪低得多，适用范围广。（4）色谱检测器比分子光谱法灵敏度更高，比质谱灵敏度低。

现代分离方法两重含义样品前处理方法：各种提取、分离技术

液液提取LLE、液相微萃取LLME

固相萃取SPE、固相微萃取SPME

微波辅助溶剂提取、加速溶剂提取超声辅助溶剂提取……现代分离分析方法:

气相色谱GC、高效液相色谱H(U)PLC、毛细管电泳CE、超临界流体色谱SFC……复杂样品分析思路获取样品中所有或大多数组分的信息

基因组学、蛋白组学、代谢组学、中药分析等获取样品中一个或多个组分的信息

环境污染物分析、食品中农药兽药分析、体液中药物分析、材料分析等1918年J.J.Thomson发明了第一台质谱；1966年Munson和Field提出了CI电离技术；1981年出现了快原子轰击（FAB）电离技术；随后出现了各种软电离技术：如基质辅助激光解吸电离源（MALDI）；电喷雾电离源（ESI）；大气压化学电离源（APCI）；感应耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）；富立叶变换质谱仪（FT-ICRMS）；

……

二、质谱法的发展质谱原理质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。1.唯一可以确定分子量的方法，特别是现代生物质谱适用于生物大分子分子量（数十万）定；2.极高灵敏度，检测限达10-14g；质谱法特点常见术语:质荷比:

离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.峰:

质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度:

检测器检测到的离子信号强度.基峰:

在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图:在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图。质量色谱图指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适。准分子离子:指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量，液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+或[M-H]-

。在ESI中,往往生成质量大于分子量的离子如M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等碎片离子：准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关，数目多表示该分子较容易断裂，丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。Ephedrine,MW=165多电荷离子：指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术,

可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。同位素离子由元素的同位素构成的离子称为同位素离子。各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便,还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等。MS电子轰击（EI）磁分析器化学电离（CI）飞行时间分析器（TOF）大气压电离（API）ESI+APCI四极滤质器

(QuadrupoleMassFilter)基质辅助激光解析质谱

（MALDI）离子阱检测器快原子轰击（FAB）离子回旋共振分析器

（ICR）按检测器分类按离子源分类EI源应用最为广泛，特别是气相色谱-质谱联用仪中应用最多的离子源，它主要用于挥发性样品的电离。原理：由进样系统进入的气体样品到达离子源，与灯丝发出的电子发生碰撞使样品分子电离。1.

电子轰击源

(electron-impactsources,EI)硬电离

一般有机化合物的电离电位为7～15eV，被具有电子能量70eV的加速电子轰击后，除了失去或得到一个电子形成分子离子以外，处于激发态的分子离子进一步裂解形成碎片离子和游离基，也可能失去一个中性分子。即70eV能量时，得到丰富的指纹图谱，灵敏度最大。适当降低电离能，可得到较强的分子离子信号，有助于确定分子量。EI电离：将具有一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离，且效率高，有助于质谱仪获得高灵敏度和高分辨率。EI图谱特征：灯丝电子束试样高温气化EI离子源EI源：可变的离子化能量

(10~70eV)电子能量电子能量分子离子增加碎片离子增加标准质谱图基本都是采用EI源(70eV)获得EI适用于Mr＜103的易挥发有机物EI优点：灵敏度高，适用性强，图谱重现性好，有标准图谱对照。

缺陷：气化时造成分子热裂解，图谱复杂，分子离子峰难寻找。（1）分子离子(Molecularion)EI源离子类型分子离子中性分子确定分子量和分子式（2）同位素离子(isotopicion)根据质谱图上同位素离子峰与分子离子峰的相对强度，可以推测化合物的分子式(Beynon表)。同位素离子峰鉴定分子中氯、溴、硫原子：

(a+b)nC6H13Br,Mr=164■含硫的样品

32S:33S:34S=100:0.8:4.4（3）碎片离子(fragmention)1)

α断裂带有电荷的官能团与相连的α碳原子之间的断裂断裂方式均裂：X—Y=X·+Y·异裂：X—Y=X++Y-半异裂：X+•Y=X++Y·含饱和杂原子+CH3CH2—I·CH3CH2·+I+均裂异裂CH3CH2++I·α-C烯烃(烯丙断裂)烷基苯(苄基断裂)2)

β断裂α碳原子和β碳原子之间的键的断裂3)

σ断裂较易发生（4）重排离子(rearrangemention)麦氏(Mclafferty)重排R1=H、R、OH、OR、NR2（5）亚稳离子(metastableion):m*离子源内亚稳离子（m1速度，

m2质量）m1m2m*m/z离子源后飞行中特点：强度低、宽、跨几个质量数，m/z非整数，易辨认用处：证明m1→m2裂解过程CI源原理：利用反应气体的离子和样品分子发生分子-离子反应而生成样品分子离子。特点：谱图简单，最强峰为分子离子峰和准分子离子峰，碎片离子峰很少。可用于负离子质谱，多数有机化合物的负离子CI质谱图灵敏度要比其正离子的CI质谱图高2-3个数量级。不适合难挥发试样。2.

化学电离源

(chemicalionizationsources,CI)软电离CI电离规律：CI电离与样品化合物类型及反应气体有关：（1）反应气体影响：甲烷：有[M+H]+、[M-H]-、[M+C2H5]+或[M+C3H5]+

异丁烷：有[M+H]+、[M+C4H9]+

氨：有[M+H]+、[M+NH4]+

（2）化合物结构影响：电负性强的元素电子捕获（或再分解）生成负离子：有

[M]-、[M-H]-及其分解离子。CI源会产生一些碎片离子，碎片会进一步离子-分子反应CI源特点：解释CI谱时，要综合分析CI谱、EI谱和所用的反应气，推断出准分子离子峰。优点：图谱简单，易测得分子量（主要任务），正、负离子模式灵敏度相当。适用于易汽化的样品。缺点：

不适于难挥发成分的分析，没有标准谱库。M=390COOC8H17COOC8H173.电喷雾电离源

(ElectrosprayIonizaton，

ESI)软电离样品从具有雾化气套管的毛细管端流出时在电场和雾化气的吹带作用下喷成无数的带电微液滴，一定温度下，液滴中的溶剂快速蒸发，液滴直径不断变小，表面电荷密度不断增大。最终使溶剂和样品离子从液滴中被排挤出，样品离子进入分析器被检测。ESI源原理：流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；从而雾化、蒸发溶剂、阻止中性溶剂分子进入后端检测。特点：1.是一种软电离方式，适于分析极性强的有机化合物;2.容易形成多电荷离子，可以测量大分子量的蛋白质;3.主要应用于液相色谱-质谱联用仪。高电场强静电场（3-5KV），形成高度荷电雾状小液滴，经过反复的溶剂挥发-液滴裂分后，产生单电荷或多电荷离子。ESI离子源ESI特点：最软电离技术单电荷或多电荷离子

利于极性强、不稳定的生物大分子的测定东莨菪碱ESIMS图谱ESI源离子类型有机小分子（1000Da以下）：一级质谱（MS）：单电荷准分子离子，很少碎片（1）分子离子峰：[M]+或[M]-（2）准分子离子峰（加合离子）：和溶液组成有关

[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+、[M+K]+、[M+NH4]+……

碱性化合物易生成质子化的分子[M+H]+；酸性化合物，易生成去质子化离子[M-H]-。

（3）聚合离子：[2M+H]+、[2M+Na]+、[2M-H]-、[3M+H]+……二级质谱及多级质谱（MS/MS）：

裂解规律同EI相似，但主要丢失为中性分子，很少丢失自由基。生物大分子：一级质谱（MS）为多电荷多离子，计算拟合获得分子量；二级质谱及多级质谱（MS/MS）产生特征碎片离子。图1马心肌红蛋白的ESI质谱图图2溶菌酶样品的ESI质谱图4.大气压化学电离

(Atomsphericpressurechemistryionization,

APCI)

APCI结构与电喷雾源大致相同，不同之处在于APCI喷咀的下游放置一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+，N2+，O2+和O+等离子，溶剂分子也会被电离，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。特点：属于“软”电离方式，适于分子质量数小于2000u的弱极性小分子化合物。只产生单电荷离子，主要是准分子离子，很少有碎片离子。主要应用于液相色谱-质谱联用仪。

APCI电离机理：质子转移和电荷交换产生正离子；质子脱离和电子捕获产生负离子等。APCI示意图APCI应用特点：（1）主要用来分析中等、弱极性小分子化合物。（2）有些分析物由于结构和极性方面的原因，ESI不能产生足够强的离子，可采用APCI方式增加离子产率，APCI是ESI的补充。（3）与CI不同，APCI无须加热样品使之汽化，因而应用范围更广。APCI电离特征：

主要产生的是单电荷离子[M+H]+或[M-H]-，分析的化合物分子量一般小于1000Da，很少有碎片离子，主要是准分子离子。银杏叶中聚戊烯醇化合物APCI-MS[M-CH2OH]ˉ5.基质辅助激光解析质谱

（Matrix-assistedLaserDesorptionIonization，MALDI）

用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。MALDI示意图MALDI源原理：待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发，使分析物与基质成为晶体或半晶体，用一定波长的脉冲式激光进行照射时，基质分子能有效的吸收激光的能量，使基质分子和样品分子进入气相并得到电离MALDI适用于生物大分子，如多肽，核酸类化合物。可得到准分子离子峰，碎片离子和多电荷离子较少。常用基质：2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基4-羟基肉桂酸等MALDI特点：

准分子离子峰很强，碎片离子峰很少，能直接测定难于电离的样品，特别是生物大分子物质如多肽、核酸、蛋白等。

适于结构复杂、不易气化的大分子，并引入辅助基质减少过分碎裂。一般采用固体基质，基质样品比为10000/1。根据分析目的不同使用不同的基质和波长。6.快原子轰击（fastatombombardment,FAB）FAB电离原理：样品溶液与甘油、硫代甘油、3-硝基苄醇等高沸点的溶剂混合滴加于样品靶上。由铯枪（或Ar、Xe）产生的高能快原子轰击到样品靶上时，部分能量导致样品气化和电离。生成的离子束由一加速电压（数kV）引出，进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）被分开，并检测器检出。FAB电离特点：（1）准分子离子为主，少许碎片离子；（2）常见的离子有[M+H]+、[M-H]-；（3）加合离子有[M+Na]+、[M+K]+，样品滴在Ag靶上时，会出现[M+Ag]+，用甘油作为基质，生成的离子中还会有样品分子和甘油生成的加合离子。（4）既可以得到正离子，也可以得到负离子。（5）在基质中加入不同的添加剂，会影响离子的强度。加入乙酸，三氟乙酸等会使正离子增强，加入NH4OH会使负离子增强。FAB应用特点：

FAB是一种软电离技术，被分析样品不须经过气化而直接电离，故常用于分析极性强、不易气化和热稳定性差的样品，如氨基酸、多肽、糖类、维生素、抗菌素等。苯芴醇FAB-MS分子式：C30H32Cl3NO

分子量：528.94

质谱法的应用定性分析标准谱图检索定性：EI(70eV)标准谱库：书库、数据库、网络检索相对分子质量测定：根据电离方式、测试条件和化合物分子结构特点，获得分子量未知化合物的结构分析分子量的确定：分子离子峰的识别分子式的确定：高分辨质谱法和同位素丰度法

分子结构的确定：计算不饱和度，特征离子和特征碎片丢失定量分析质谱直接定量分析：应用少复杂混合物定量分析：GC-MS、LC-MS、CE-MS…….1、高效液相色谱法（HPLC）高压泵流动相溶剂废液色谱柱检测器WatersUPLC超高效液相色谱仪经典LCHPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200µm重力或低压泵很慢3-10µm高压泵快(1～10mL/min)20世纪60年代末70年代初发展起来三、液相色谱法及液质联用基本理论塔板理论速率理论A涡流扩散项B/u分子扩散项（忽略）Cu传质阻力项分离模式吸附色谱法（液固吸附色谱LSC）分配色谱法（液-液分配色谱LLC+键合相色谱）离子交换色谱法（IEC）化学键合相色谱尺寸排阻（凝胶）色谱法SEC、GPC亲和色谱HPLC特点高效液相色谱法的优点（与经典液相色谱法与气相色谱法比较）

（1）分离效能高

（2）选择性高

（3）检测灵敏度高

（4）分析速度快（5）应用广泛，适于沸点高、热稳定性差的物质（占70-80%），特别是蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。Highperformanceliquidchromatography,

HPLC方法特点（1）分离分析同时完成：融分离和检测于一体，可以实现复杂混合物的多组分同时分析。（2）多种检测器，适用对象广：

紫外UV、二极管阵列PAD、荧光、化学发光、电化学、质谱MS等。（3）仪器联用，多重信息，定性能力强：LC-MS(NMR、IR…)

保留时间定性、光谱定性、质谱及串联质谱定性等。（4）仪器联用，灵敏度高，专属性好：强大的分离功能和质谱的高灵敏度、高专属性。（5）分离模式多，适用范围广：生物、药物、食品、环境、材料、农业、医学等。①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。建立HPLC分析方法的步骤分析方法定性分析对照定性：纯物质色谱保留对照定性经验规律和文献值定性联机定性定量分析归一化法外标法(校准曲线法)内标法主要应用定性分析已知化合物鉴定：合成产物、天然化合物成分分析质量标准：中药、食品标准指纹图谱定量分析复杂样品目标化合物定量分析：众多国家和国际标准方法，如食品、药品、环境、卫生、工业等理论研究化学平衡性质：保留时间→溶解热、熵变及焓变动力学过程：峰扩宽程度→扩散系数、反应速率常数物化性质：保留体积或峰面积→相对分子质量、表面积、孔率分布及液膜厚度LC-MS（MSn）特点灵敏度高选择性好专属性好快速SIM、SRM等测试模式灵活多样MSn丰富的分子结构信息，无对照品，也能定性分析图谱直观样品前处理简单多组分同时定性或定量测定多电荷离子的产生适合于分析大分子…2、液相色谱-质谱联用技术

（liquidchromatography-massspectrometry,LC-MS）色谱质谱联用的接口接口:是将色谱仪与质谱仪直接联接起来的装置。作用：将通过色谱仪分离开的各种组分逐一送入质谱仪进行分析。接口要协调前后两种仪器的输出和输入间的矛盾。将两种仪器的分析方法结合起来，协同作用，取长补短，获得单独使用时所不具备的功能。因此，接口是色谱质谱联用技术中的关键装置。色谱质谱联用的分类气相色谱-质谱联用：开发最早的色谱联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物。液相色谱-质谱联用：液相色谱-质谱联用的接口问题得到解决，近年有了飞速发展。适宜分析大分子（包括蛋白，多肽多聚物等）、不挥发。热不稳定、极性的化合物。毛细管电泳-质谱联用：近年发展迅速，特别对生物大分子的分类分析十分有用。液质联用与气质联用的区别:

气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。

液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

现代有机和生物质谱进展

在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）应运而生。仪器硬件概览仪器结构典型的配置图2.质谱仪质谱仪包括真空系统、进样系统、离子源、质量分析器、检测器和数据处理系统。2.1真空系统

质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。2.2进样系统进样系统是将分析样品引入到离子源的装置。进样方式：（1）.直接进样（2）.仪器联用的进样（GC、LC、CE)色谱-质谱联用仪的接口和色谱仪组成了质谱的进样系统。接口应满足：（1）.接口的存在既不破坏离子源的高真空，也不影响色谱柱的分离柱效；（2）.接口应能使色谱分离后的各组分尽可能多的进入质谱仪的离子源，同时使色谱流动相尽可能的不进入质谱的离子源；（3）.接口的存在不改变色谱分离后各组分的组成和结构。离子源将欲分析样品的原子或分子电离，得到带电离子，并对离子进行加速使其进入质量分析器。根据电离方式的不同，常用的有：EI(ElectronImpactIonization):电子轰击电离—硬电离。CI(ChemicalIonization):化学电离—核心是质子转移。FD(FieldDesorption):场解吸—目前基本被FAB取代。FAB(FastAtomBombardment):快原子轰击—或者铯离子(LSIMS,液体二次离子质谱)。

离子源ESI(ElectrosprayIonization):电喷雾电离—属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)

APCI(AtmosphericPressureChemicalIonization):大气压化学电离—同上，更适宜做弱极性小分子。APPI(AtmosphericPressurePhotoSprayIonization):大气压光喷雾电离—同上，更适宜做非极性分子。

MALDI(MatrixAssistedLaserDesorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子。2.4质量分析器质量分析器是质谱仪的核心，质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序进行分离并排列。常用的质量分析器有：磁质量分析器四级杆质量分析器飞行时间质量分析器离子阱质量分析器2.5检测器质谱仪常用的检测器有：直接电检测器、电子倍增器、闪烁检测器和微通道板等。电子倍增器运用质量分析器出来的离子轰击电子倍增管的阴极表面，使其发射出二次电子，再用二次电子依次轰击一系列电极，使二次电子获得不断倍增，最后由阳极接受电子流，使离子束信号得到放大。

离子源：产生离子化，并将产生的离子在电场的作用下进去毛细管。3.系统结构图毛细管：离子导入通道，将离子源产生的离子传输进入质谱。同时，隔离外部的常压与质谱内部的高真空离子光学组件：包括Skimmer1，八级杆以及Lens1和Lens2.进一步除去溶剂和中性分子，高效的离子传输组件，并聚焦随机运动的离子进去四级杆。离子束整形器：将随机运动的离子压缩为一个薄层，进入脉冲发生器。减少离子在纵向的扩散，提高分辨率。脉冲发生器：以一定的频率在纵向施加高压，将从离子束整形器过来的离子快速抛入飞行器。飞行器：离子在飞行管内纵向飞行，不同质荷比离子通过飞行管的时间不同。检测器：包括微通板、闪烁器和光电倍增管。高增益、寿命长、线性范围宽施加到离子的电势能转化为动能：zV=1/2mv2（1）

m：离子的质量；z为离子所带的电荷数目；

V为施加到离子的电势，它对于所有质量的离子是相同的；v为离子的飞行线速度，离子质量越大，飞行速度就越慢。离子飞行的线速度v等于飞行距离L除以飞行时间t:v=L/t（2）

L为由仪器的飞行管所决定的常数联立公式（1）和（2），得到zV=1/2m（L/t)2

因而离子质荷比正比于飞行时间的平方m/z=2Vt2/L2基本原理1ESI源-大气压电喷雾离子源雾化器的喷雾针被带了高电压的半圆柱形电极环绕，带有被测物质离子的流动相，在雾化针尖端发生雾化。在半圆形电极和毛细管间的电压不同，产生一个电场，使液滴表面富集带同种电荷的离子，而内部带相反电荷聚集，形成带电液滴细的喷雾，液滴在电场的作用下，飞向毛细管。加热的氮气干燥气体反向流动，带走液滴中的中性的溶剂分子，从而收缩液滴，直到排斥的静电力超过液滴表面张力，从而库伦爆炸。这个过程不断重复，直到待分析物离子最终变成气态进去毛细管。本院仪器离子源技术和原理ESI源

加热的氮气干燥气毛细管入口雾化气溶剂喷雾电喷雾离子-4000V气帘雾化器组件（nebulizer）是同轴套管大气压电喷雾电离过程Coulomb爆炸++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--溶剂蒸发++带电液滴分析离子溶剂离子簇分析离子

Rayleigh极限2APCI源-大气压化学电离离子源APCI的电离是在常压下的气态化学电离（CI）过程，是ESI电离的一种有效的补充。溶剂或反应气在电晕针的作用下先带电，再把电荷转移到化合物形成离子。一般只产生单电荷离子，且需要在高温的离子化环境下操作。属于质量-流量敏感型离子化技术，样品分子量越大，性能越高。适合分析中等极性到弱极性的化合物。[Solvent+H]++ASolvent+[A+H]+雾化蒸发液滴气相电离APCI大气压化学电离Vcap电晕电流雾化气压力Fragmentor干燥气温度和流速蒸发室温度电荷转移至分析物分子蒸汽通过电晕针放电形成带电荷的反应剂离子溶剂在蒸发器中蒸发+含有气溶胶的分析物分析物离子+++++++++++++++++++++++++++流动相分析物溶剂--------->[溶剂+H]+[溶剂+H]++M--------->溶剂+[M+H]+APCI电离过程离子化气相

CI质子化（例如，H3O+

）（碱）电荷交换去质子化（酸）电子捕获（卤素，芳族化合物）蒸发室温度较高温度利于去溶剂化和气化样品。太高温度导致样品分解。通常：与电喷雾相比，APCI对于流动相、流速或添加剂依赖性较小。注意溶剂的选择。甲醇是比乙腈好的选择，减小碳化。APCI

ESI离子在溶液中以已生成化合物无需具有挥发性是分析热不稳定化合物的首选除了生成单电荷离子之外还可以生成多电荷离子

APCI离子在气态条件中生成化合物需具有一定的挥发性化合物必需是热稳定的只生成单电荷离子离子源的选择

ESI

杂质：造成目标离子的响应下降表面活性剂与待测离子竞争（注意液相瓶、样品瓶、无纺布的清洗）正离子模式下：避免：磷酸和磷酸盐、硫酸盐、硼酸盐（由于会形成强离子对）三氟乙酸属于能形成强离子对的化合物负离子模式下：碱金属盐也抑制离子的形成三乙胺质子亲合力强，应避免存在三乙胺，用甲酸流动相至少冲一周以上参比电喷雾与大气压化学电离的比较

电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1ml／min.断裂程度:APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子。LC-MS分析条件的选择和优化1.接口的选择：

ESI适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（如蛋白质）

APCI不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极性或中等极性的小分子的分析。2正、负离子模式的选择：选择的一般原则为：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行。正离子ES模式：适合于碱性样品，amines,amides,aminoacids,antibiotics等有杂原子，可接受质子。如NH2、N、NH、CO、COOR酸性流动相加挥发性酸：甲酸、乙酸加盐：甲酸铵乙酸铵负离子ES模式：适合于酸性样品，acids,hydroxyls,phosphates,sulfates；含强负电性基团有杂原子，可失去质子。如COOH、OH

中性偏碱性流动相一般加氨水可正可负:比较灵敏度3流动相的选择常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节pH值。LC／MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须＜lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸铵＜10一5mmol/l。送样前一定要摸好LC条件，能够基本分离，缓冲体系符合MS要求。4流量和色谱柱的选择不加热ESI的最佳流速是1—50ul／min，应用4.6mm内径LC柱时要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm内径的微柱，TIS源最高允许lml／min，建议使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此时UV图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用MRM的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。5辅助气体流量和温度的选择雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果。操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言，一般情况下选择干燥气温度高于分析物的沸点20℃

左右即可。对热不稳定性化合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度和流量小一点的。质量分析器的分类：双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).四极质谱仪(Q).飞行时间质谱仪(TOF).离子阱质谱仪（TRAP）付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).┏四极+TOF（Q-TOF）串列式多级质谱仪┫三重四极（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF6.质量分析器:是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。如何看质谱图：1.基本信息(1)确定分子离子,即确定分子量氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:(3)峰强度与结构的关系丰度大反映离子结构稳定在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，总是在分子最薄弱的地方断裂。不同类型有机物有不同的裂解方式相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异需要经验记忆。2.质谱解析的一般步骤(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好)(1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适当(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，光谱，波谱数据等.(3)尽可能判断出分子离子。(4)假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，H2O，HF，OCH3......(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作出它的质谱进行对比。3.有机质谱的特点优点:(1)定分子量准确，其它技术无法比。(2)灵敏度高，常规10-7—10-8g,单离子检测可达10-12g。(3)快速，几分甚至几秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分离的混合物特别有效,其它技术无法胜任。(5)多功能，广泛适用于各类化合物。局限性:

(1)异构体，立体化学方面区分能力差。(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自己动手，须专人操作。(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。具体应用领域医药学：药物代谢、药物动力学、杂质分析、天然产物分析生物化学：肽、蛋白质、寡核苷酸、糖环境化学：农药和农残分析、有机污染物、土壤/食品/水分析临床医学：新生儿检查、糖化血红蛋白（糖尿病）、血红蛋白变异、胆酸食品科学：香料、添加物、包装物、蛋白质、致癌物法医学：滥用药物、爆炸物、兴奋剂检测兽医学：兴奋剂、磺胺类药物、抗体合成化学：有机金属化合物、有机合成物有机化学：表面活性剂、染料（1）药物：药物合成：反应过程监测、中间体、目标化合物及副反应产物分析等。药物筛选及极性优化：药物分