第十章紫外-可见分光光度法

第十章

紫外可见分光光度法一、光的波粒二象性二、电磁波谱三、物质对光的吸收四、电子跃迁类型五、常用概念六、吸收带与结构关系第一节

基本原理2023/2/6分光光度法：是基于被测物质对光的选择性吸收而建立的分析方法。应用对象：一般是能吸收UV-ViS的分子或某些特定离子本章重点：（1）光的波粒二象性（2）紫外可见光度法基本原理（3）定性定量方法2023/2/6一、光的波粒二象性波动性粒子性

E

光的折射光的衍射光的偏振光的干涉光电效应E：光子的能量（J,焦耳）

：光子的频率（Hz,赫兹）

：光子的波长（cm）c：光速（2.99791010cm.s-1）h：Plank常数（6.625610-34

J.s

）2023/2/6二、电磁波谱

射线x射线紫外光红外光微波无线电波10-2nm10nm102nm104nm0.1cm10cm103cm105cm可

见

光紫外可见光区为200~800nm,其中紫外200~400nm、可见400~800nm,在此区域是分子产生的吸收2023/2/6三、物质对光的吸收1、物质颜色与光的关系完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光吸收池黑色无色透明互补色蓝色2023/2/62、吸收原理与光的关系光作用于物质时，物质吸收了相应波长的光，而显示出特征的颜色，物质对光的吸收是由于分子中的价电子在不同的分子轨道之间跃迁而产生的，吸收具有选择性（量子化）S2S1S0S3E2E0E1E3h

2023/2/6物质的电子结构不同，吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择性吸收。原子吸收得到是锐线光谱、分子吸收得到是带状光谱例：A物质B物质同理，得：1ev=1.610-19J.

2023/2/63.

分子吸收光谱产生类型电子能级跃迁振动能级跃迁2023/2/64、紫外可见吸收光谱（曲线）意义以波长（）为横坐标，吸光度（物质对光吸收程度,用A表示）为纵坐标所绘制的曲线，即为吸收光谱。2023/2/61)同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最佳吸收波长λmax2)不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似（如右图），且λmax值不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax都不同2023/2/63)吸收曲线的形状、λmax及吸收强度(ξ表示)等与分子的结构密切相关。4)不同浓度的同一种物质，在某一波长下吸光度有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。5)在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。2023/2/6胆甾醇异亚丙基丙酮6)共轭基团相同的不同分子，紫外、可见吸收光谱相似。O=C–C=C两分子具有相同的共轭基团2023/2/61、有机化合物价电子类型有机化合物中存在三种价电子：σ电子、π电子、n电子它们对应有σ、σ*、π、π

*及n轨道。如甲醛分子分子轨道理论：成键轨道—反键轨道当外层价电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁，所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

COHnpsH四、电子跃迁类型2023/2/62、电子跃迁类型

（1）σ→σ＊跃迁

所需能量最大；σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁；饱和烷烃的分子吸收光谱属于该类跃迁，出现在远紫外区；吸收波长λ<200nm。例：甲烷λmax为125nm,乙烷λmax为135nm。作为溶剂使用2023/2/6（2）n→π＊跃迁

所需能量最小；n电子只有吸收近紫外光的能量才能发生跃迁；含有杂原子不饱官能团的分子吸收光谱属于该类跃迁，出现在近紫外区；吸收波长λ>200nm。吸收强度较弱，通常检测不到。例：丙酮羰基产生该类跃迁，其λmax为279nmε为10-30

2023/2/6（3）n→σ＊跃迁

所需能量较大。吸收波长多为150～250nm，大部分在远紫外区，而在近紫外区的仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。如下表所示2023/2/6（4）π→π＊跃迁（最重要的跃迁）

所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，εmax在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。

1)不饱和烃π→π*跃迁，乙烯π→π*跃迁的λmax为165nm，εmax为1×104L·mol-1·cm－1,强吸收。2)共轭烯烃中的→*波长增加,强度增大

(HOMOLVMO)

max

165nm217nm

₃

₁

₂

2023/2/6共轭烯烃中→*跃迁所需能量降低，因此，对应波长增大，同时也属于强吸收带如

max=217nm，εmax

为21000紫外光谱电子跃迁类型：n—π*跃迁

π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及存在基团有密切联系根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型；根据吸收带波长和电子跃迁类型

→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）2023/2/62.无机物吸收光谱与电子跃迁(自学)

（1）电荷转移吸收光谱无机络合物例：

λmax=490nm,εmax>104，定量测定灵敏度高。电子受体电子给予体2023/2/6（2）配位场跃迁吸收在配体的配位场作用下，过渡元素5个能量相等的d轨道和镧系、锕系元素7个能量相等的f轨道分裂成几组能量不等的d轨道及f轨道，吸收辐射后，低能态的d或f电子分别跃迁至高能态的d或f轨道，即产生了d一d和

f一f

跃迁。2023/2/6八面体场∆E配位场跃迁属禁戒跃迁，吸收强度弱，εmax<102，不适合用于定量分析，但可用于研究配合物的结构及无机配合键理论等。2023/2/6五、常用概念和术语1、吸收峰：吸收曲线上吸光度最大的地方，其位置用对应的波长为max表示2、生色团：有机化合物分子结构中含有π→π＊和n→π＊跃迁的基团，能在紫外可见光范围内产生吸收的基团称为生色团。2023/2/63、助色团：含有非键电子的杂原子饱和基团，当它们与生色团相连时，能使生色团吸收峰向长波方向位移并增强其强度的官能团。如–OH、–NH2、–SH及卤族元素4、红移和蓝移：λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。5、增色和减色：吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应。2023/2/62023/2/65、强带和弱带：在紫外可见光区内，凡是εmax

值大于104的吸收峰为强带；小于102的吸收峰为弱带A:吸收峰εmax=103

B:吸收峰εmax=105

A

2023/2/6六、吸收带与分子结构关系

电子跃迁类型与分子结构及其存在的基团有密切的联系，因此，可以根据分子结构来预测可能产生的电子跃迁，或者根据吸收谱带来推测分子的结构。

例如：饱和烃只有σ→σ＊跃迁；烯烃有σ→σ＊跃迁也有π→π＊跃迁；醛、酮同时存在σ→σ＊、n→σ＊

、n→π＊

、π→π＊四种跃迁而产生相应吸收带。2023/2/61、R吸收带（特殊基团带）：由n→π＊

电子跃迁而产生的吸收带，是杂原子不饱和基团这类生色团的特征。处于~300nm，是弱吸收，有时被掩盖。2、K吸收带（共轭作用）:由于非环状共轭双键中的π→π＊跃迁而产生的吸收带。该吸收带属于强吸收带。3、B吸收带（芳香族特征带）：由于苯分子的振动和转动能级跃迁产生的吸收带2023/2/6在230nm~270nm出现，属于较弱的吸收带，在蒸汽时出现精细结构（很多小锯齿峰），在极性溶液中精细结构消失，出现宽峰。

4、E吸收带（芳香族特征带）：由苯环中环状共轭系统的π→π＊跃迁而产生的吸收带，该吸收带特点是产生两个紧相邻的E吸收带。E1（在180nm处）、E2（在200nm处）带，两个吸收带均属于强吸收带。2023/2/6图10－42023/2/6

四、影响吸收光谱的因素

1、共轭效应的影响CH2=CH2

171nm10000CH2=CH-CH=CH2217nm21000CH2=CH-CH=CH-CH=CH2

258nm34000化合物

λmax(nm)

εmax

电子共轭体系增大，红移，增大。2023/2/6空间阻碍使共轭体系破坏，λmax蓝移，εmax

减小。R=R'=Hλmax

=294nm,εmax=27600

R=H,R'=CH3,

λmax

=272nm,εmax=21000

2023/2/62、取代基的影响取代基

-SR-NR2-OR-Cl-CH3红移距离(nm)45403055助色团取代，

π→π*跃迁吸收带发生红移。2023/2/63、溶剂的影响气态溶剂：环己烷溶剂：水对称四嗪在蒸气态、环己烷和水中的吸收光谱1)

对吸收谱带精细结构影响2023/2/6无溶剂效应极性溶剂效应π*nnπππ*能量2)

对π→π*跃迁和n→π*跃迁影响溶剂极性增加，

π→π*跃迁吸收带红移，

n→π*跃迁吸收带蓝移。2023/2/6π→π*和n→π*跃迁的溶剂效应溶剂正己烷

CHCl3CH3OHH2Oπ→π*λmax/nm230238237243n→π*λmax/nm329315309305报告某物的紫外、可见吸收光谱时，需注明所使用的溶剂。2023/2/63)

溶剂的选择a.

溶剂应能很好地溶解被测试样，溶剂对溶质应是惰性的。b.

在溶解度允许的范围内，尽量选择极性较小的溶剂。c.

溶剂在样品的吸收光谱区应无明显吸收2023/2/6第十章

紫外可见分光光度法一、朗伯-比尔定律二、偏离吸收定律因素第二节

吸收定律2023/2/6一、朗伯-比尔定律1、透光率

（透射比、透射率）透光率定义T取值为0.0%~100.0%T=0.0%T=100.0%入射光

I0透射光

It2023/2/62、Lambert–BeerLaw当一定波长单色光通过某物质溶液时，入射光强度I0与透射光强度It之比的对数与该物质的浓度及液层厚度成正比。此时物质对光吸收的程度（吸光度，用A表示）数学表达式为入射光

I0透射光

Itc:溶液浓度l:液层厚度E:吸光系数l2023/2/63、吸光度与透光率关系

透光率吸光度1.00.5ACA10050T%TT=0.0%A=∞T=100.0%A=0.0A=0.4343T=36.8%2023/2/64、吸光系数E：比例常数

入射光波长物质的性质温度取值与浓度的单位相关c：mol/L

E

摩尔吸光系数，

L·mol–1·cm-1

c：g/L

E

a

质量吸光系数，

L·g–1·cm-1

c：g/100mL

E

百分比吸光系数

溶剂2023/2/65、吸光度的加合性二、吸收定律偏离因素标准曲线法测定未知溶液的浓度时发现标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为吸收定律的偏离。

2023/2/61、物理因素

难以获得真正的纯单色光。朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。2023/2/62、化学性因素

朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；该假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才符合。当溶液浓度c>10－2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合、聚集等相互作用，直接影响了对光吸收。故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。

2023/2/6

另外当溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物形成等化学反应时，也会使吸光质点浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

CrO42-＋2H＋

=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。2023/2/6第十章

紫外可见分光光度法一、基本组成二、分光光度计类型三、仪器测量误差四、实验技术第三节

分光光度计2023/2/6一、分光光度计基本组成0.575光源单色器吸收池检测器显示I0It参比样品入射光

I0透射光

It2023/2/6二、分光光度计类型

（1）单波长单光束分光光度计0.575光源单色器吸收池检测器显示2023/2/6（2）单波长双光束分光光度计差值光源单色器吸收池检测器显示光束分裂器2023/2/6（3）双波长分光光度计双波长分光光度计结构特点两个单色器不需要参比溶液显示2023/2/6}两波长处的背景吸收相等定量分析关系式：自动校正背景吸收原理适合测定混浊液2023/2/6三、仪器测量误差根据误差传递公式，可以推导出浓度测量的相对误差为T=0.368=36.8%A=0.4343为了减少测量误差，控制溶液的吸光度

A=0.2~0.7T=70~10%0.3682023/2/6四、实验条件选择

1.仪器条件:任何分光光度计都有一定的测量误差，这是由于光源不稳定、实验条件的偶然变动、读数不准确等因素造成的。这些因素对于试样的测定结果影响较大，特别是当试样浓度较大或较小时。因此，要选择适宜的吸光度范围，以使测量结果的误差尽量减小。通常将待测溶液的投射比（T）选在10%~70%或吸光度（A）在0.2~0.7即可（如何实现？）2023/2/62、测量波长选择无干扰，选择max

有干扰，根据吸收大、干扰小原则选定波长A

A

待测组分干扰组分2023/2/63、参比液（空白溶液）选择原则：扣除非待测组分的吸收试液

显色剂

溶剂

吸光物质

参比液组成无吸收无吸收光学透明溶剂基质吸收无吸收吸收

不加显色剂的试液无吸收吸收

吸收

显色剂基质吸收

吸收

吸收

吸收

显色剂

+试液

+待测组分掩蔽剂2023/2/64、显色反应有机物质官能团强吸收直接测定UV-VIS官能团弱吸收衍生化反应UV-VIS显色反应无机物质通常经过显色反应生成吸光系数大的有色物质进行测定，以提高灵敏度332+桔红色

max

邻二氮菲2023/2/6（1）显色剂选择：a.显色反应灵敏度高，有较强的吸光能力；b.反应生成物组成恒定、稳定性好；c.对照性好，显色剂与有色配合物的λmax差别在60nm以上。（2）显色剂用量、溶液酸度、显色温度、显色时间等均需通过实验确定。2023/2/6第十章

紫外可见分光光度法一、定性定量分析二、实例应用第四节

紫外可见光谱法应用2023/2/6一、定性分析与定量分析法定性分析基础定量分析基础物质对光的选择吸收ABA

在一定的实验条件下，物质对光的吸收与物质的浓度成正比。A

C增大2023/2/61、定性方法定性主要的依据→吸收光谱所具有的以下特征吸收光谱的形状；吸收峰的数目；吸收峰的位置（波长）；吸收峰的强度；相应的吸光系数2、定量方法类型<1>、单组分定量☆吸光系数法（单色光很纯）：在给定实验条件下2023/2/6由A=cl计算例如：维生素B12样品2.50mg用水溶解成100ml后，盛于1cm吸收池中，在361nm测得A值为0.507，求吸光系数和含量。已知吸光系数(比吸光系数）的标示量为E=207(代表含量为100%时的吸光系数)解：E=A/(cl)=0.507/0.0025=202.8g/100ml2023/2/6样品中B12=E(样)/E(标)=202.8/207=98.0%☆标准曲线法（单色光不纯）:依据A=kc测定时，配制一系列浓度不同的标准溶液，在同一条件下分别测定A，然后以A为纵坐标，浓度为横坐标绘制A-c曲线（标准曲线如右图）。根据样品溶液测得A值，从曲线上求得样品的浓度。该法对仪器要求不高，适合大批量样品分析Aci2023/2/6

芦丁含量测定0.710mg/25mL2023/2/6☆对照法：在相同条件下，在线形范围内配制样品溶液和标准溶液，在选定波长处，分别测定吸光度。由朗伯-比尔定律求算。A样品=样品c样品b，A标=标c标b

因同种物质，同台仪器，相同厚度吸收池及同一波长，故：样=标，所以C样=（A样/A标）C标例如：维生素B12注射液含量测定：精密吸取B12注射液2.50ml，加水稀释至10.00ml摇匀。另配制B122023/2/6标准液：精密称取B12标准品25.0mg，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀。在361nm处，用1cm吸收池分别测得样品和标准溶液的A值为0.508和0.518，求B12注射液的浓度。解：c样品=98.1μg/ml<2>、多组分定量多组分的定量依据：A总=Aa+Ab+Ac+…在混合组分测定中，遇到各组分吸收光谱双向重叠2023/2/6相互干扰时，可根据测定目的、要求和光谱重叠的不同情况采用下列方法：三种情况：

☆两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量2023/2/6☆两组分吸收光谱部分重叠λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Ca2023/2/62023/2/6☆两组分吸收光谱完全重叠——混合样品测定a.解线性方程组法b.等吸收双波长消去法c.导数光谱法2023/2/6a.解线性方程组法步骤：2023/2/6b.等吸收双波长法步骤：

消除a的影响测b2023/2/6消去b的影响测a

注：须满足两个基本条件选定的两个波长下干扰组分具有等吸收点；选定的两个波长下待测物的吸光度差值应足够大。例如阿司匹林中水杨酸含量测定2023/2/6c.导数光谱法利用光吸收对波长导数曲线来确定和分析吸收峰位置和强度。一定条件下,导数值与浓度呈线性关系.随导数阶数增加，峰数增加，峰变窄，分辨率提高，有力于重叠谱带及尖峰的分离和鉴别.2023/2/6吸收光谱和导数光谱λλλλλ2023/2/6在一定条件下，利用带有微处理机的分光光度计可直接绘制标准溶液的导数光谱；利用导数光谱的特征对组分进行定性定量分析。此方法尤其对多组分的同时测定、浑浊溶液测定、背景干扰严重测定。峰谷值的波长下绘制导数值和浓度的标准曲线；在相同条件下测定样品溶液的导数光谱，由回归方程或标准曲线计算出待测物的浓度。定量数据的测量：基线法；峰-谷法；峰-零法2023/2/6二、实例应用

1、配合物组成的测定M+nR=MRn

若M和R均不干扰MRn

吸收CM固定

CR从

0开始增大，得到一系列CR/CM值不同溶液，在同一波长下测定溶液的A，然后作A对CR/CM图R=0,M=0,MRn

>0ACR/