免疫细胞化学染色在白血病免疫分型和肿瘤细胞骨髓转移课件

免疫细胞化学染色在白血病免疫分型和肿瘤细胞骨髓转移

鉴定中的应用

前言

白血病和肿瘤细胞骨髓转移的诊断主要靠骨髓细胞病理学诊断。骨髓细胞病理学诊断的方法主要有细胞形态学、细胞化学染色、免疫细胞化学染色、细胞遗传学以及分子生物学。根据文献报道，根据细胞形态对白血病进行分型的准确性是64%～77%。细胞形态学和细胞化学结合可使准确性达86%[2]

，但对于AML-M0

、M7、M5a、MAL鉴定有一定的困难。而免疫细胞化学染色在一定程度上可以解决此类问题。

骨髓转移性癌（BMT）原发于非造血组织的恶性肿瘤转移至骨髓的总称，骨髓不仅是造血组织恶性肿瘤的好发部位，同时又是其它恶性肿瘤常转移的部位。肿瘤经血行或淋巴管转移到骨髓，有的能找到原发灶，而有的找不到原发灶，这就需要在骨髓内直接鉴定肿瘤细胞。转移到骨髓内的癌细胞同血液系统的恶性肿瘤细胞及转移癌细胞之间，在形态上有一定的区别，而对于分化较差的癌细胞其形态较难辨认，易同急性淋巴细胞性白血病、淋巴瘤细胞以及其它的肿瘤细胞如神经母细胞瘤、肾上腺母细胞瘤等相混淆不易鉴别。转移到骨髓中的肿瘤细胞无组织结构特点，加之肿瘤细胞化学染色缺乏一定的特异性，使转移性肿瘤细胞的鉴定具有一定的困难，也需要用免疫细胞化学染色来解决。二、免疫细胞化学染色理论基础（一）白血病免疫分型

各种血细胞来源于多能干细胞，经过分化发育而成为成熟的血细胞。这些血细胞在分化发育过程中，在其表面出现不同阶段的特异性分化抗原，利用各种特异性单克隆抗体和酶联免疫方法测定这些抗原，从而精确测定细胞类型及不同的分化阶段。白血病细胞具有与其对应的分化抗原,因此利用分化抗原可对白血病进行免疫学分型。

（二）肿瘤细胞鉴定肿瘤是由正常细胞恶变所致，故细胞膜表面、细胞质内和细胞核内可能存在着与正常相比在质或量上明显异常的物质，这些物质可以成为抗原，因而可以用特异性抗体通过免疫细胞化学染色检测。由于来源于不同组织的肿瘤细胞因为其所含的蛋白质和酶的不同，利用针对这些蛋白质和酶的各种特异性单克隆抗体对肿瘤细胞种类鉴别。三实验方法种类（一）仪器法：流式细胞仪、自动免疫染色仪（二）手工法（玻片法）

1根据二抗标记物不同：碱性磷酸酶法、

辣根过氧化物酶法、荧光法、抗生物素-生物素法等。2根据实验原理：二步法、三步法等。

五、实验步骤

1.选择厚薄均匀的骨髓涂片5～6张，根据需要用免疫组化圈笔在涂片上画直径1.5cm左右的圆圈数个。然后将玻片置于95%酒精溶液中固定5～10分钟或4℃丙酮10分钟。2.取出玻片用流水冲洗，再用PBS缓冲液冲洗，滴加3%H2O250μl，阻断内源性过氧化物酶，室温孵育10分钟。3.PBS冲洗，5分钟×3。4.滴加非免疫动物血清50μl，室温孵育10

分钟。5.根据形态学初检选择需要标记的第一抗体滴在圆圈内并做好记号，然后将玻片置于湿盒内室温下1.5小时或4℃过夜。6.PBS冲洗，5分钟×3六、实验结果

细胞膜、细胞浆或细胞核上出现棕黄色或棕黄色颗粒则为阳性，说明此细胞含有针对所标记的单克隆抗体的抗原，如果不显棕黄色或棕黄色颗粒则为阴性。七、注意事项1.标本应新鲜，彻底干燥后方能检测。通常放置24小时后检测,但标本采集后应在3-4天内测定完毕。若标本采集后不能及时测定，勿预先固定和冰箱内保存。2.滴加单克隆一抗时，格外小心避免混淆。3.滴加二抗、显色剂时无需分开。4.整个检测过程中自固定后标本均应保持湿润，不能干燥，直至复染后方能使其干燥。八、常用单克隆抗体及谱系特异性（一）白血病免疫分型常用单克隆抗体T林巴细胞：CD2

CD3CD5CD7CD8CDlαTCR-αβTCR-γδB林巴细胞：CD10CD19CD20CD24CD22CD79αCyIgM髓系细胞：MPOCD13CD14CD15CD64CD65CD68CD118血型糖蛋白A巨核细胞：PPOCD41CD42CD61HLA-DR非系列特异性：TdTHLA-DRCD34

(二)根据白血病免疫学积分系统，将AL分为四型1.急性未分化型白血病（AUL）

髓系和T或B系抗原积分均≤2。2.急性混合细胞白血病

有三种类型：双表型、双克隆型和双系列型。髓系和B或T淋巴系积分均＞2。3.①伴有髓系抗原表达的ALL（My+ALL）T或B淋巴系积分＞2同时粒-单系抗原表达，但积分≤2。②伴有淋巴系抗原表达的AML（Ly+AML)

髓系积分＞2同时淋巴系抗原表达，但积分≤2。4.单表型表达淋巴系（T或B）者髓系积分为0，表达髓系者淋巴

系积分为0[5]。

(三)急性髓细胞白血病微分化型(M0)特点及免疫

表型特点:M0为形态学不能分型;常规细胞化学染色阴

性;无Auer小体。免疫表型：髓系分化抗原CD13、CD33、CD14、CD15、CD11b中至少有一种阳性。不表达B系特异性抗原（CD10、CD19、CD22、CD24）和T系特异性抗原（CD2、CD3、CD5）。可表达无系列特异性未成熟标志CD34、TdT、HLA-DR。（四）鉴定骨髓转移性肿瘤细胞常用的单克隆抗体1.Cytokertin(Pan)细胞角蛋白（广谱）：广谱细胞角蛋白CK（AE1/AE3）主要标记角化上皮、复层鳞状上皮、复层上皮、增生的角化细胞和单层上皮，用于鳞癌、各种腺癌、移行细胞癌、小细胞癌等。2.Cytokeratin(HighMW)细胞角蛋白（高分子量）：简称CK高分子。细胞角蛋白34βE12为高分子量的细胞角蛋白，主要用于鳞癌的诊断。3.Cytokeratin(lowMW)细胞角蛋白（低分量）：简称CK低分子。细胞角蛋白35βH11为低分子量的细胞角蛋白，主要用于腺癌的诊断。10.神经元特异性烯醇化酶(NSE)

主要分布于神经元和一些神经内分泌细胞中,用于神经内分泌肿瘤的辅助诊断。11.S-100Protein

用于室管膜瘤、神经母细胞瘤、神经鞘瘤等的诊断与鉴别诊断。李晓燕，女，29岁住院号：159299肺科—3床2004年9月15日骨髓片图片资料崔单雨，女，9岁住院号：144061小儿科—15床2004年4月5日骨髓片肾上腺母细胞瘤?神经母细胞瘤？神经母细胞瘤？CD45史夕琴，女，30岁住院号：161136血液科—8床2004年10月6日骨髓片邵乐，男，6岁住院号：160462小儿科—19床2004年9月21日骨髓片韩茂芬，女，57岁住院号：165004感染科—27床2004年10月6日骨髓片CD7攀胜甫，男，42岁住院号：166298消化科—4床2004年11月27日骨髓片杨雨甜，女，1岁3个月住院号：167108小儿科—13床2004年11月29日骨髓片病例测定结果

表1FAB分型25例AML中，形态学和免疫组化均符合髓系白血病16例（占64%）；4例（16%）既有髓系又有T系抗原表达；5例（20%）既有髓系又有B系抗原表达，与文献[3]报道较一致。表1显示，髓系抗原CD13和CD33，在AML中表达较高（分别为80%和76）。表125例AMLCD抗原阳性表达情况

表211例ALL患者8种CD抗原表达显示，淋系抗原（CD3，CD7，CD19，CD20）在ALL呈高表达，而髓系抗原（CD13CD14CD33）表达率低，其中有2例既表达淋系又表达髓系抗原。表211例ALLCD抗原阳性表达情况

表33例FAB难分型的白血病，2例髓系表达并且CD14阳性确诊为M5b，一例既有T系表达又有髓系表达，确诊为M+ALL（急性淋巴细胞性白血病髓系表达）。表33例FAB不能定型的CD抗原阳性表达情况%

表410例肿瘤细胞BM转移，其中5例癌细胞BM转移，4例CK低分子阳性，确诊为腺癌。1例CK高分子阳性确诊为鳞癌。4例似诊为淋巴瘤BM浸润？恶性组织细胞病（恶组）待排，2例T系表达，2例B系表达，确诊为淋巴瘤BM浸润。1例形态上难以确定是癌还是瘤的，因CK低分子阳性，确诊为腺癌细胞。表410例肿瘤细胞BM转移CD和CK阳性表达情况

病例讨论FAB对急性白血病分型，可将大部分白血病分型，仍有小部分很难定型，尤其是POX染色阴性M0、M5a、L2及MAL。由于白血病细胞形态多变性及形态学的主观性，加上有些化学染色由于试剂质量﹑方法等因素也缺乏一定特异性，所以有小部分急性白血病根据形态及化学染色很难定型，特别是M0只能用免疫组化定型。表33例FAB难以定型白血病，其中1例形态上象M5b，细胞核明显扭曲折叠，染色质细致，浆量丰富。M5bPOX染色阳性率>3%，但其POX染色100%阴性，PAS染色呈细小颗粒弱阳性，非特异性脂酶染色阴性，而M5b应该是阳性。所以此例病例是M5b？还是L2？很难定型。但其免疫组化显示CD14、CD33、CD13阳性，不表达淋系抗原。所以此病例确诊为M5b。其它两例也同此例类似。由于CD单抗直接测定细胞的分化抗原，且特异性强，所以可以弥补FAB分型的不足。表1和表225例AML和11例ALL免疫表型结果分析可以看出，急性白血病免疫分型与FAB形态学分型有较好的一致性。AML免疫分型与形态学分型完全符合者（单纯表达髓系抗原）占64%，ALL免疫分型与形态学分型完全符合者（单纯表达淋系抗原）占81%，与文献报道[4]基本一致。约36%AML表达淋系抗原（Ly+M）和18%ALL表达髓系抗原(M+ALL)。这是因为正常造血干细胞存在髓系和淋系抗原在其分化过程中逐渐形成系列专一抗原表达，而白血病细胞不能遵循正常造血干细胞的发育﹑分化规律。因而出现抗原表达的紊乱，表现出免疫标志的异质性[4]。Ly+AML和ly-AML及M+ALL和M-ALL患者在对化疗的反应，预后等方面有很大差别。根据文献报道Ly+AML患者较之ly-AML患者对化疗反应差，预后不佳，但M+ALL则无此特征[4]，因此免疫分型可为临床制定化疗方案和判断疾病预后提供实验室依据。临床上有些病人肿瘤细胞BM已经转移，但原发灶有时很难找到。那么BM转移的肿瘤细胞的鉴定则成为重要和必须。但从形态上有时只能确定是癌或是肉瘤，当形态不典型时，有时也不能区别。而用CK高分子单抗与CK低分子单抗，不仅能区分鳞癌和腺癌，同时将腺癌与肉瘤区分。CK高分子阳性是鳞癌，CK低分子阳性是腺癌，肉瘤细胞CK高分子和CK低分子都是阴性。淋巴瘤BM浸润和早期恶组，由于细胞少，从形态和化学染色上很难鉴定，特别易将组织细胞样淋巴瘤诊断为恶组。随着免疫组化和分子生物学技术的发展及应用，对以前诊断的恶组重新进行研究，发现许多所谓的“恶组”病例瘤细胞并不是组织细胞源性，而是来源于其它细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞等。第四军医大学病理教研室对13例恶性组织细胞增生症免疫组织化学研究结果,9例T细胞性淋(CD45RO阳性),2例组织细胞肿瘤(CD68阳性),1例杂合表达(CD45RO和CD68同时阳性),1例T细胞源性间变性大细胞淋巴瘤(CD45RO,EMA和CD30阳性),无一例B细胞或NK细胞肿瘤(CD20和CD56全部阴性).WHO（2000）分类中，为避免混淆，未再提真正的恶性组织细胞增生症，而将组织细胞肉瘤作为单独一类列出，并提出组织细胞肉瘤的诊断标准：（1）表达2种或2种以上单核细胞