中药指纹图谱的研究与实践课件

中药指纹图谱的研究与实践第一部分概述一、建立中药指纹图谱质量标准的必要性质量稳定的原料是生产质量稳定的产品的先决条件。中药材绝大部分来源于生物，其活性成分大部分为生物体内次生代谢产物，少数为初生代谢产物。产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术、产地加工、炮制方法等对中药材的化学成分影响很大。大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明。单一指标的定性、定量分析，不能有效地控制中药材或中成药的质量。确保中药的生物等效性。三、中药指纹图谱的作用作为药品的质量标准组成部分企业产品质量的内控标准企业药品生产的过程控制企业产品创优或打假第二部分中药材指纹图谱的建立品种药用部位产地栽培技术产地加工方法炮制供试品的制备方法测定方法、条件的考察方法学考察：稳定性、精密度、重现性对照指纹图谱的建立中药材指纹图谱的定义：

中药材指纹图谱系指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱。如果原药材需经过特殊炮制（如醋制、酒制、炒炭等），则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。1、名称中文名、汉语拼音2、来源原植、动物：科名、中文名、拉丁学名、药用部位、产地、采收季节、产地加工、炮制方法等。矿物药：矿物的类、族、矿石名或岩石名、主要成分、产地、产地加工、炮制方法等。来源动、植物药材：应固定品种、药用部位、产地、采收期、产地加工和炮制方法。矿物药：固定产地和炮制、加工方法。供试品的取样：保证供试品的代表性和均一性。3、供试品的制备应根据中药材中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。制备方法必须确保该中药材的主要化学成分在指纹图谱中的体现。对于注射剂用中药材，可按注射剂制备工艺制备供试品，制定指纹图谱。5、测定方法●包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。●应根据中药材所含化学成分的理化性质，选择适宜的测定方法，建议优先考虑色谱方法。●对于成分复杂的中药材，必要时可以考虑采用多种测定方法，建立多张指纹图谱。●以色谱方法制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定；以光谱方法制定指纹图谱，相应条件也必须固定。6、指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱●根据供试品的检测结果，建立指纹图谱。●采用HPLC和GC制定指纹图谱，其记录时间根据样品所含成分的情况而定，一般为1小时；采用TLCS制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。●化学成分类型复杂的品种，必要时可建立多张指纹图谱。●指纹图谱的建立：根据10批次以上供试品的检测结果所给出的相关参数，制定指纹图谱。(3)指纹图谱的评价以指纹图谱相似度评价软件进行评价以相对保留时间和峰面积比值进行评价共有指纹峰面积的比值以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。各共有指纹峰面积比值必须相对固定。峰面积比值的要求：Ai≥20％At:

SD≤±20％10%At≤Ai<20%At:

SD≤±25%Ai<10％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。二、起草说明目的在于说明制定指纹图谱检测标准中各个项目的理由，规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等。既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试验数据。1、名称、汉语拼音阐明确定该名称的理由与依据。已有国家标准或地方标准的中药材，应引用标准上的名称。其他著作或文献上已记载的中药材，应引用文献名，提供依据。新发现的中药材，应根据中药命名原则进行命名。2、来源对于多来源的中药材，必须固定单一品种。对于多药用部位的中药材，必须固定单一药用部位。已有国家标准（包括药典和部颁标准）的中药材，应引用国家标准；已有地方标准的中药材，除引用地方标准外，必须附标准的复印件。注射剂用中药材一般固定一个产地，如固定多个产地，需制定各产地中药材的指纹图谱。3、供试品的制备说明选用制备方法的依据。供试品需要提取、纯化，应考察提取溶剂、提取方法、纯化方法等，提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分。供试品需要粉碎检测，应考察粉碎方法、粒度等。4、参照物的制备参照物的选择及其依据。根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品或内标物作为参照物。试验样品制备的依据。根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备，说明制备理由。精密度试验主要考察仪器的精密度。取同一供试品，连续进样5次以上，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。采用相似度软件评价，要求相似度大于0.9。人工评价：采用HPLC和GC制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的RSD不得大于3％，其他方法不得大于5％。采用光谱方法检测的供试品，RSD不得大于3％。重现性试验：主要考察实验方法的重现性。取同一批号的供试品5份以上，按照供试品的制备方法制备供试品并进行检测，考察色谱峰的相对保留时间、峰面积比值的一致性。采用相似度软件评价，要求相似度大于0.9。人工评价：采用HPLC和GC制定指纹图谱，在指纹图谱中规定共有峰面积比值的各色谱峰，其峰面积比值的RSD不得大于3％，其他方法不得大于5％。采用光谱方法检测的供试品，RSD不得大于3％。6、指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱根据供试品的检测结果制定指纹图谱，采用阿拉伯数字标示共有峰，用“S”标示参照物的峰。采用HPLC和GC制定指纹图谱，应提供对照指纹图谱2倍以上的记录图，以考察样品中的主要成分是否完全出峰。提供建立指纹图谱的有关数据，包括各共有峰的相对保留时间、相似度或各共有峰面积的比值。采用光谱方法建立的指纹图谱，也必须提供相应的数据。(2)共有指纹峰的标定根据10批次以上供试品的检测结果，标定中药材的共有指纹峰。说明标定共有指纹峰的理由。附各批供试品的图谱。(3)共有指纹峰面积的比值根据10批次以上供试品图谱中各共有指纹峰面积的比值，计算平均比值。列出各批供试品的检测数据。分析各批供试品的检测结果是否合格(4)非共有峰面积计算10批次以上供试品图谱中非共有峰总面积及占总峰面积的百分比。列出各批供试品的检测数据。分析各批供试品非共有峰面积是否合格。7、注射剂用中药材指纹图谱检测标准（草案）书写格式中药材的名称、来源供试品制备对照品溶液或内标物溶液的制备测定方法（包括仪器、试剂、测定条件和测定方法）指纹图谱及各项技术参数起草说明三、中药材指纹图谱研究实例(一)肉苁蓉药材的指纹图谱研究Lichrosorb250*4.6mm10μm（大连依利特公司Diamasil200*4.6mm5μm（迪马公司）

Lichrospher250*4mm5μm(默克公司)1、色谱柱考察甲醇－水系统

乙腈－水系统0.095%磷酸乙腈-0.095%磷酸系统2、流动相考察3、检测波长考察4、精密度试验样品12345相关系数(中位数)0.99300.99280.98310.99290.99665、稳定性试验样品0h2h4h8h16h24h相关系数中位数）0.99250.98540.99890.99270.98020.9988样品12345相关系数（中位数）0.99760.99940.99340.99540.99696、重现性实验荒漠肉苁蓉管花肉苁蓉沙苁蓉盐生肉苁蓉不同产地管花肉苁蓉C.tubulosa指纹图谱不同寄主管花肉苁蓉指纹图谱相似度比较样品中国柽柳甘蒙柽柳短穗柽柳细穗柽柳甘肃柽柳直立柽柳相似度0.99660.98580.98700.99910.99650.9380(二)白鲜皮药材的指纹图谱研究茵芋碱白鲜碱黄柏酮梣酮白鲜皮的对照指纹图谱1、中药白鲜皮指纹图谱的建立特征区种内指纹区2、不同产地白鲜皮的指纹图谱考察特征区种内指纹区白鲜皮根皮与木心部分指纹图谱比较根皮木心3、不同药用部位指纹图谱的区别(三)红花药材的指纹图谱研究红花商品药材指纹图谱红花商品药材指纹123456红花商品药材指纹图谱新疆产红花指纹图谱(四)黄芪药材的指纹图谱研究1、色谱条件与系统适用性试验色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂，型号为Polaris5μC18-A250×4.6mm；检测器：分别以蒸发光散射和紫外二种检测器检测，蒸发光散射检测器采用法国SEDEX75型，蒸发温度=40℃,氮气压力=2.2Bar，灵敏度=7，Units/Volt=2000；紫外检测波长为280nm；柱温：30℃；理论塔板数：按黄芪甲苷计，应不低于3000；进样量：20ul；流动相：水－乙腈梯度洗脱时间(min)流速（ml/min）水(%)乙腈(%)01.0973401.07030651.01585701.01585751.0973标样叠加图芒柄花素苷异黄烷苷-1异黄烷苷-3毛蕊异黄酮黄芪甲苷芒柄花素毛蕊异黄酮苷黄芪药材蒸发光散射检测器检测指纹图谱黄芪药材紫外检测器(280nm)检测指纹图谱黄芪甲苷芒柄花素毛蕊异黄酮苷

芒柄花素苷

毛蕊异黄酮

甘肃黑龙江陕西其他河北山西内蒙古辽宁不同产地黄芪蒸发光散射检测器检测指纹图谱比较不同产地黄芪药材紫外检测器检测指纹图谱比较陕西山西甘肃内蒙古黑龙江河北其他辽宁4、八个省50种药材样品指纹图谱考察8个省50种药材样品的紫外检测考察结果条形图（毛蕊异黄酮苷峰面积）

8个省50种药材皂苷类成分的考察图谱（黄芪甲苷峰面积）

5、黄芪药材ELSD检测相似度结果6、黄芪药材紫外检测相似度结果7、黄芪药材ELSD检测重现性考察8、黄芪药材紫外检测重现性考察(五)柴胡药材挥发油指纹图谱研究柴胡药材芳香水的GC对照指纹图谱AgilentHP-5，30m×530mm×5mm

DB-WAX30×530mm×1mm

DB-62430×320mm×1.8mm

AgilentHP-5，30m×3200mm×0.25mm

色谱柱比较流速考察：上图：柱流速0.8ml/min，中图：1.0ml/min，下图：1.5ml/min升温程序考察：初始100℃3℃/min升至170℃，保持3min初始60℃，保持2min，3℃/min升至70℃，保持3min，5℃/min升至200℃，保持3min

初始40℃，保持2min，1℃/min升至50℃，保持2min，3℃/min升至70℃，保持3min,7℃/min升至220℃，保持3min

初始35℃，保持2min，1℃/min升至40℃，保持2min，3℃/min升至60℃，保持3min,7℃/min升至200℃，保持3min

稳定性和精密度试验重现性试验河北易县北柴胡野生

河北安国北柴胡

内蒙古喀喇沁旗锦山镇南柴胡野生

山西省宁武县南柴胡野生

北柴胡南柴胡栽培北柴胡栽培南柴胡第三部分中成药指纹图谱的建立供试品的制备方法测定方法、条件的考察中药材、中间体、成品的相关性考察方法学考察：稳定性、精密度、重现性试验指纹图谱的建立成品的稳定性试验中药注射剂及其有效部位或

中间体指纹图谱的检测标准定义：中药注射剂指纹图谱系指中药注射剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该注射剂特性的共有峰的图谱。要求：以有效部位或中间体投料的中药注射剂，还需制定有效部位或中间体的指纹图谱。一、指纹图谱的检测标准内容：供试品和参照物的制备、检测方法、指纹图谱及技术参数。1、供试品的制备要求：根据注射剂、有效部位或中间体中所含化学成分的理化性质和检测方法的需要，选择适宜的方法进行制备。注意：制备方法必须确保该注射剂、有效部位或中间体主要化学成分在指纹图谱中的再现。2、参照物的制备制定指纹图谱必须设立参照物，应根据供试品中所含化学成分的性质，选择适宜的对照品作为参照物；如果没有适宜的对照品，可选择适宜的内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法。3.测定方法包括测定方法、仪器、试剂、测定条件等。应根据注射剂、有效部位和中间体所含化学成分的理化性质，选择适宜的检测方法。建议优先考虑色谱方法。对于成分复杂的注射剂、有效部位和中间体，特别是复方中药注射剂，必要时可以考虑采用多种检测方法，建立多张指纹图谱。制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板、试剂、测定条件等必须固定，采用光谱方法制定指纹图谱，相应的测定条件也必须固定。4.指纹图谱及技术参数(1)指纹图谱根据供试品指纹图谱的检测结果，建立指纹图谱。采用HPLC和GC制定指纹图谱，根据样品中所含成分的情况确定记录时间；采用薄层扫描法制定指纹图谱，必须提供从原点至溶剂前沿的图谱；采用光谱法制定指纹图谱，必须按各种光谱的相应规定提供全谱。对于化学成分类型复杂的中药注射剂、有效部位和中间体，特别是中药复方注射剂，必要时建立多张指纹图谱。2.共有指纹峰的标定根据10批次以上供试品的检测结果，标定共有指纹峰。色谱法采用相对保留时间标定指纹峰，光谱法采用波长或波数标定指纹峰。色谱峰的相对保留时间根据参照物的保留时间计算。3、指纹图谱的评价以指纹图谱相似度评价软件评价以色谱峰面积的比值评价共有指纹峰面积的比值以对照品作为参照物的指纹图谱，以参照物峰面积作为1，计算各共有指纹峰面积与参照物峰面积的比值；以内标物作为参照物的指纹图谱，则以共有指纹峰中其中一个峰（要求峰面积相对较大、较稳定的共有峰）的峰面积作为1，计算其他各共有指纹峰面积的比值。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。以光谱方法制定指纹图谱，参照色谱方法的相应要求执行。峰面积比值的要求：保留时间小于或等于30分钟的共有峰：Ai≥20％At：SD≤±20％；

20％At>Ai≥10％At：SD≤±25％；

10％At>Ai≥5％At：SD≤±30％；Ai<5％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30分钟的共有峰：

Ai≥10％At：按上述规定执行；

Ai<10％At：峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。非共有峰面积

供试品图谱与指纹图谱比较，非共有峰总面积不得大于总峰面积的5％。(5)中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性

为了确保制备工艺的科学性和稳定性，应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定各图谱之间的相关性。二、起草说明目的在于说明制定检测标准中各个项目的理由，规定各项目指标的依据、技术条件和注意事项等，既要有理论解释，又要有实践工作的总结及试验数据。1、供试品的制备

应说明选用制备方法的依据。如供试品需要提取、纯化，应考察提取溶剂、提取方法、纯化方法等，提取、纯化方法应力求最大限度地保留供试品中的化学成分。

2、参照物的制备

应说明参照物的选择和试验样品制备的依据。应根据供试品中所含成分的性质，选择适宜的对照品或内标物作为参照物。参照物的制备应根据检测方法的需要，选择适宜的方法进行，并说明制备理由。

3、检测方法

根据供试品的特点和所含化学成分的理化性质选择相应的检测方法。应说明选择检测方法的依据和该检测方法的原理，确定该检测方法的方法学考察资料和相关图（包括稳定性、精密度和重现性）。对于所含成分类型较多的中药注射剂、有效部位和中间体，特别是复方中药注射剂，一种检测方法或一张图谱不能反映该注射剂、有效部位和中间体的固有特性，必要时可以考虑采用多种检测方法或一种检测方法的多种测定条件，制备多张指纹图谱。制定指纹图谱所采用的色谱柱、薄层板等必须固定厂家和型号、规格，试剂、测定条件等也必须相应固定。采用光谱法建立指纹图谱，其相应的检测条件也必须固定。稳定性、精密度、重现性的考察方法和要求参见中药材部分。

4、指纹图谱及技术参数

(1)指纹图谱

根据供试品图谱所给出的相关参数，制定指纹图谱，采用阿拉伯数字标示共有峰，用“S”标示参照物的峰。采用高效液相色谱法和气相色谱法制定指纹图谱，应提供2倍于对照指纹图谱的记录图，以考察样品中的主要成分是否全部出峰。提供建立对照指纹图谱的有关数据，包括各共有峰的相对保留时间、各共有峰面积的比值。采用光谱方法建立的指纹图谱，也必须提供相应的数据。

(2)共有指纹峰的标定

应根据10批次以上供试品图谱的检测结果，标定中药注射剂、有效部位和中间体的共有指纹峰。说明标定共有指纹峰的理由，并附各批供试品图谱。

(3)共有指纹峰面积的比值

应根据10批次以上供试品图谱中共有指纹峰面积的比值，计算平均比值，列出各批供试品的检测数据。

(4)非共有峰面积

计算10批次以上供试品图谱中非共有峰面积及占总峰面积的百分比，列出各批供试品的检测数据。

(5)中药材、有效部位、中间体和注射剂指纹图谱之间的相关性

应根据中药材、有效部位、中间体和注射剂的指纹图谱，标定各指纹图谱之间的相关性。必要时可采用加入某一中药材、有效部位或中间体的供试品或制备某一中药材、有效部位或中间体阴性供试品的方法标定各指纹图谱之间的相关性。提供相关性研究的指纹图谱。

(6)中试产品的指纹图谱申报临床的中药注射剂必须提供三批以上中试产品的指纹图谱。申报生产的中药注射剂必须提供十批以上中试产品的指纹图谱。5、中药注射剂指纹图谱检测标准（草案）书写格式(1)供试品的制备(2)对照品溶液或内标物溶液的制备(3)测定方法（包括仪器、试剂、测定条件和测定方法）(4)指纹图谱及各项技术参数(5)起草说明(6)有效部位或中间体的指纹图谱检测标准及起草说明三、中药注射剂指纹图谱研究实例

参芪注射液指纹图谱的研究处方：黄芪、党参黄芪药材指纹图谱十批黄芪指纹图谱相似度结果党参药材指纹图谱十批党参指纹图谱相似度结果参芪扶正注射液中间体指纹图谱10批参芪扶正注射液中间体指纹图谱相似度结果十批参芪扶正注射液指纹图谱参芪扶正注射液指纹图谱相似度结果党参参芪中间体黄芪注射液党参、黄芪——中间体——注射液相关性注射液中间体、黄芪和党参提取液

的总离子流图不同检测波长下的指纹图谱指纹图谱中部分指纹峰的结构确证毛蕊异黄酮葡萄糖苷芒柄花素葡萄糖苷9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-葡萄糖苷tR＝31.446min毛蕊异黄酮葡萄糖苷

447:M+H469:M+Na915:2M+NaM=446

tR＝42.763min芒柄花素葡萄糖苷431:M+H453:M+Na883:2M+NaM=430第四部分指纹图谱的其他作用一、指纹图谱在黄芪注射液制备工艺统一中的作用8个厂家注射液皂苷成分不同企业生产注射液指纹图谱比较(ELSD检测)8个厂家注射液黄酮类成分不同企业生产注射液指纹图谱比较(紫外检测)根据三种制备工艺制备的注射液

紫外检测指纹图谱比较

药材：山西浑源白：部颁标准红：企业1黄：企业2根据三种制备工艺制备的注射液ELSD检测指纹图谱比较

药材：山西浑源白：部颁标准红：企业1黄：企业2二、柴胡注射液的指纹图谱研究12个企业第一阶段送检样品考察图谱（1）

江西银涛批号020920

河南新乡新辉批号021010

焦作康华批号020705

西安黄河批号020828

12个企业第一阶段送检样品考察图谱（2）四川升和批号020822

昆明兴中批号020307

河南百泉批号020703

广东博罗先锋批号020703

12个企业第一阶段送检样品考察图谱（3）山西晋新双鹤批号0208192

河南浙川批号020602

四川升和沪医批号020822

三九万荣批号020607

研究单位采用三种制备工艺生