第4次课天然产物研究实验室技术2(纯化)

提取基础分离白桦酸酯合成（化学、生物转化）第三讲天然药物活性成分的提取与分离

重要性：－－天然药物的开发（WTO，知识产权）柱色谱

ColumnChromatogrphy

常压柱色谱(0.1~50g)（OrdinaryColumnChromatogr.）吸附柱色谱分配柱色谱植物有效柱色谱离子交换柱色谱成分分离凝胶过滤柱色谱主要手段聚酰胺柱色谱大孔吸附树脂一、吸附性色谱Al2O3orSilicagel

生物碱水溶性Al2O3甾体脂溶性Silicagel挥发油脂溶性

1装柱Al2O3：吸附剂:样品(20~50:1)→(20~100:1)Silica：吸附剂:样品(30~100:1)→(300~400:1)1)干法与TLC吻合度较好，溶剂消耗少2)湿法紧密，前沿整齐2上样1)湿法：溶剂溶解上样（少量），低极性2)干法：低极性溶剂溶解性差3洗脱常压、低压、梯度洗脱4收集与检查等份TLC、UV二、聚酰胺（Polyamide）1原理（1）氢键吸附原理：基于酰胺键酚类、酸类、醌类、硝基化合物成氢键能力与溶剂有关水<甲醇<乙醇<丙酮<稀氨液<稀NaOH氢键吸附规律：基团多少；基团位置；芳香核；共轭双键；分子内氢键（2）极性吸附原理：基于非极性脂肪链萜类、甾体、生物碱黄酮苷非水（正相）；含水（反相）2聚酰胺粉的制备国产（15~30目）、层析用（80~100目）粗粉蒸馏水浸泡过夜，磨细，混悬液直接使用抽滤后，60~80度烘干2~3小时备用。3操作装柱：细粉水浸泡装柱，自然沉降上样：20~30%水溶液上样，上样量40-60:1洗脱：水、含水醇、95%醇、3%NaOH、5%NaOH4再生：5%NaOH三、分配柱色谱

1原理利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，而达到分离的一种柱层析方法。分配系数差异愈大，分离效果愈好。2支持剂硅胶、硅藻土、纤维粉3溶剂系统的选择PC、TLC4操作（1）装柱（2）上样（3）洗脱四、凝胶柱色谱（SephadexLH-20）

1葡聚糖凝胶简介由葡聚糖凝胶SephadexG-25交联亲脂性羟丙基而制备，是同时具备吸附色谱、分配色谱和分子筛功能的独特色谱介质。溶剂系统没有限制，包括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂。大量文献证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药有效成分如苷类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、帖类、甾类、多酚的分离。德国科学家HansHenke著有SephadexLH-20凝胶色谱分离专著。2原理分子筛：分子的大小和形状吸附色谱：被分离化合物与凝胶间的氢键分配色谱：被分离化合物在流动相（溶剂）和固定相（凝胶）之间的分配3操作（1）装柱洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱。（2）上样（3）洗脱水溶性好：水或电解质溶液水溶性差：醇水或丙酮水极性较小：丙酮、氯仿（4）浓缩视情况而定（5）再生洗脱剂平衡有污染：0.2NNaOH→0.5NHCl浸泡水洗净→平衡保存：50%丙酮水溶液4应用实例川芎里的腺嘌呤贝母里的腺苷浙贝宁、茄啶日本附子里的乌头碱银杏黄酮苷夏枯草中的夏枯草黄酮苷、皂苷升麻中的酰胺苷水蔓菁中的水蔓菁萜苷鹿衔草中的鹿蹄草苷淫羊霍中的淫羊霍苷多种中草药中的芦丁芸香苷红花中的槲皮素、芦丁、山柰酚、红色素等多种黄酮麦冬中的麦冬黄酮鹿蹄草中的儿茶素紫草中的萘醌、多酚五、离子交换柱色谱1原理利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而进行的交换性柱色谱方法。2影响离子交换的因素PH值欲交换化合物的性质欲交换化合物的浓度温度交换溶剂交换流速树脂用量3树脂的选择4操作（1）树脂预处理（2）装柱（3）上样（4）交换（5）洗脱（6）树脂再生六、大孔吸附树脂色谱1简介

大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一种新工艺，是由苯乙烯、二乙烯或a-甲基丙烯酸酯等聚合而成的高分子网状孔穴结构。

大孔树脂吸附色谱操作的基本程序大多是：提取液－通过大孔树脂－吸附上有效成分的树脂－洗脱－洗脱液回收－洗脱液干燥－半成品。药液通过大孔树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的有效方法。该技术目前已较广应用于新药开发和生产中,主要用在分离和提纯过程中。2原理：非极性吸附树脂在吸附药液中成分时，主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用，不同的树脂有不同的针对性。4影响分离的因素分子极性大小分子体积PH值树脂柱的清洗洗脱液的选择3操作（1）树脂预处理（2）装柱（3）上样（4）洗脱（5）树脂再生5优点可有效地去除水煎液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分；有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性；大孔树脂吸附技术还能缩短生产周期，所需设备简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。6实际应用

适合中等程度的水溶性化合物：天然色素，从发酵液中得到抗生素（青霉素、先锋霉素、螺旋霉素）、蛋白质（胰岛素、肽系抗生素）、功能性食品添加剂（维生素）等。聚苯乙烯合成吸附树脂吸附含有π电子的化合物，如含有苯环和共轭双键的化合物；甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附含羧基、酯基、氨基、酰胺基等与H可结合的官能团的化合物。

特殊柱色谱（SpecialColumnChromatogr.）

干柱柱色谱减压柱色谱植物有效成分特殊柱层析短柱柱色谱分离新方法闪式柱色谱棒色谱

一、干柱柱色谱1简介2特点（1）优点分离效果比湿法装柱高；可用薄层最佳分离条件直接套用；对有荧光或颜色的物质，可在紫外灯下将已分离的各层带分别切开，避免常规液相层析中因流出液收集不当而造成的层带交叉；适用于制备性分离；设备简单，消耗溶剂少，工时省，（2）缺点样品容量比湿法装柱小，因此，消耗填充剂量大。（1）填充剂种类氧化铝活性III~V吸附色谱硅胶活性II~III干柱聚酰胺色谱分配色谱3原理与薄层色谱相同，借颗粒间的孔隙所产生的毛细作用而展层，因此，可套用薄层条件，分离效果亦相同。干填充剂颗粒的深孔内充满空气，溶剂和样品分子很难进入颗粒的深孔，吸附与解吸主要在外部表面进行。克服了样品分子由于进出填充剂深孔所造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。（2）展开剂多采用混合溶剂避免溶剂解混产生，影响分离效果

解决办法：搭配极性相差适当的溶剂如：石油醚－乙醚氯仿－乙醇石油醚－乙醇氯仿－甲醇注意：苯、苯酚等溶剂对紫外光灯检出层带有影响。（3）分离条件探索探索和选择对样品分离度最大的填充剂和展开剂薄层色谱（最佳分离条件）（4）样品容量1:100~1:300样品只能与吸附剂的外部表面接触

4操作（1）柱的制备（常用50cm）聚乙烯薄膜柱玻璃柱（2）加样和展开加样：溶液加样；拌样加样展开（3）层带的定位及分割

二、减压柱色谱（抽柱VacuumLiquidChromatography)1简介

简便、实用、快速的色谱方法，其基本原理与吸附层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的极性分段划分。（粗分）2操作

G-4垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽滤瓶、减压泵及分部收集瓶组成。装柱上样洗脱收集3注意事项真空度：20~70mmHg洗脱剂极性：由小到大梯度递增交叉色带4应用二萜生物碱的分离黄酮类化合物的分离三、短柱柱色谱短柱柱色谱在制备量分离方面有独到之处，在微量成分的富集上有一定实用价值。1短柱色谱理论经典色谱理论：柱效随柱径的加大而下降，柱子愈长，分离越好，柱效越高。近来研究发现，此理论有一定局限性，在实践基础上，提出新的观点：柱径加大后，在适当条件下柱效反而提高。（1）适当条件：柱径：3~20cm短粗柱柱长：5~30cm（2）原因1)Knox提出“无限直径效应”，认为柱短，柱径相对较粗，层析相对集中于中部进行，消除或减少了“柱壁效应”。2）柱短，可使洗脱液在柱内受阻减少，且截面增大，使自然流速大大增加，为采用高细度吸附剂提供了可能条件。2色谱方法同普通柱色谱，不同之处在于采用短粗柱，使用吸附剂粒度细小，且粒度范围窄，装柱应尽量均匀。洗脱时多采用梯度洗脱，对洗脱剂选择较严格。3注意事项填料、洗脱剂Rf>0.2预纯化操作四、闪式柱色谱（FlashChromatography)

20世纪70年代后发展起来的一种快速柱色谱技术。1简介柱短，分离时间短，快，分离效率高。闪式硅胶（FlashSicicagel）进口，国产（山东即墨化学试剂厂）球型微粒，粒度在40-63μm（230-400目）之间（均匀）加压色谱0.3-1Kg/cm210mg-10g样品10-15min2操作

与普通柱色谱法基本相同。装柱：湿法干法（20cm）上样：拌样湿法洗脱：Rf0.2-0.3加液8-10cm，加压3实际应用皂苷、甾体、生物碱、黄酮五、棒色谱（StickChromatography)1简介

与制备型薄层色谱原理相同,分离量大。把硅胶、氧化铝等制成园柱形的棒，下端上样，上行展开而达到分离目的。2操作

制棒上样展开引导座－－两端相通，内填层析硅胶展开装置－－层析槽，密封罩收集3应用生物碱、皂苷、甾醇等加压柱色谱（PressureLiquidChromatogr.）类型

低压柱色谱加压柱层析中压柱色谱高压柱色谱优点

分离因子a高，故能完成复杂的分离过程（a=两组分的相对保留时间之比，分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标）

制备型与分析型的区别：分析型：不要求样品回收制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的层析装置和操作系统基本原理1加压柱色谱效果Speed分析型制备型ResolutionLoad与Load相关的因素柱径、柱长、粒度、填充剂密度

2加压柱色谱目的得到单体化合物Lab.一定纯度生产规模回收率单位时间内分得的化合物量

洗脱液流速快可用更细的颗粒，分辨率提高避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而导致分解（最大优点）3分类（Classifcaton）AnalyticalHPLC:μg－<5mgPrep.HPLC:5mg－1gLow-pressureLC:10mg－1gMedium-pressureLC:100mg－100g

选择制备型系统需要考虑：以上各法的极限（适应范围）根据以上条件要求而选用的方法上样量：质量超载（少量样品）or体积超载（多量样品）柱尺寸，固定相粒度，压力，洗脱剂经验积累4操作TLC探索条件（色谱系统选择）分析型小试优化条件（超载）套用优化条件（制备）正式操作获得纯品分析鉴定纯品再生柱：5倍柱体积正相：actone—water—methanol—THF－dichloromethane反相：water－methanol5Prep.LC的各种条件的应用情况及优化（1）Column:loading,f,size,columnefficiency,a,K’numberoftheoreticalplates,resolution（2）Stationaryphase:固—液、粒度大小硅胶－普通、键合相AgNO3—coatedsilicagel－涂层AgNO3分离萜类—分开不同双键数目或位置Paired-ionChromatogr.－生物碱在柱上增加一种离子，该离子与欲分离物相反，从而成为离子对，而成中性，易分离Chiralstationaryp