毛细管电泳法 作业

分析化学

毛细管电泳法

CapillaryElectrophoresis,CE

陈朵花

一、概述generalization

在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。

1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；

发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；经典电泳分析

traditionalelectrophoresis

利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳；按载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳；传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。1981年，Jorgenson等用75μm内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化

电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高

在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少

进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；

二、电渗现象与电渗流

electroosmosisandelectroosmoticflow1.电渗流现象

当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。

当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。

电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。

2、分离过程

电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。

带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；

中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。3.HPCE中电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为层流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。

4

电泳和电渗

电渗流的表示电渗流的大小可用淌度(μeo)或电渗流系数表示

μeo=υeo/E=l/(teo﹒E)电渗流速度毛细管有效长度

电渗流流出时间

电场强度5.HPCE中电渗流的作用

电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；

ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；

ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。6、HPCE中影响电渗流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1）.电场强度的影响

电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。2）.毛细管材料的影响

不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；3.电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响

对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。4.温度的影响

毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；

焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；

HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1度，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。

分离效率和分离度

分离效率柱效可以用理论塔板数n表示

n=(µep+µeo)Vl/(2DL)

毛细管电泳分离的柱效方程

理论塔板高

H=L/n

n=5.54(χ/W½)2实验上可按上式求出理论塔板数

χ为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离W½为电泳峰的半高峰宽

分离度

影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：t1、t2分别为两个组份的迁移时间W为峰底的宽度

三、影响分离效率的因素—区带展宽

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

区带宽度展宽因素

焦耳热进样电泳扩散毛细管壁对组分的吸附

三、影响分离效率的因素—区带展宽

factorsinfluencedtheefficiency—bandbroadening

1.纵向扩散的影响

在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样的影响

当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：

Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。3.焦耳热与温度梯度的影响

电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：m—电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cm—电解质浓度；

散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；4毛细管壁对组分的吸附

电泳峰拖尾或变形，甚至消失。抑制吸附作用常用的方法有：●使用极端pH条件●加入中性盐或两性离子化合物●对毛细管内壁进行涂层处理

需要注意：方法也会抑制或改变电渗流

四毛细管电泳的主要分离模式

毛细管区带电泳（capillaryzoneelectrophoresis，CZE）胶束电动色谱（micellarelectrokineticchromatography,MEKC)毛细管凝胶电泳（capillarygelelectrophoresis,CGE)毛细管等速电泳（capillaryisotachophoresis,CITP)

毛细管等电聚焦（capillaryisoelectricfocus,CIF)毛细管电色谱（capillaryelectrochromatography,CEC)毛细管电泳最基本的分离模式。背景电解质是缓冲液，分离是基于样品中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用以提高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。在CZE中，影响分离的操作条件为：

√分离电压

√背景电解质种类、浓度和pH

√添加剂种类和浓度

一）、毛细管区带电泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。

正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；

阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。

最基本、应用广的分离模式；

二）毛细管凝胶电泳CGE

是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方式

用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构，按分子的大小分离

毛细管凝胶电泳综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点:电泳峰尖锐，柱效极高短柱上实现极好的分离试样容量为10－12g主要缺点:制备柱较困难，寿命较短已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用于DNA序列快速分析。

三）毛细管凝胶电泳

1.缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。四）胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在电场力的作用下，胶束在柱中移动。

2.电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流>ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；

5.色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；

五）毛细管等电聚焦CIEF:建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差异基础上的分离方法。蛋白质的等电点(pI):指蛋白质分子的净电荷数为零时的pH值。

1.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；六）毛细管等电聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF

4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；

5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。方法:

进样－等电聚焦－检测先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)，置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端，置于阴极电解质如NaOH中。施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管内很窄的不同pH区域内聚焦.在阳、阴极电解液中加入盐如NaCI或NaOH,破坏pH梯度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。

六）毛细管等电聚焦五、进样系统毛细管通道十分细小，所需样品不过数nl，所以不能采用色谱的进样方式。通过让毛细管与样品溶液直接接触，然后由重力、电场力或其它动力来驱动样品进入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。进样系统必须包括动力控制、计时控制、电极槽或毛细管移位控制等机构。

进样方式：

电动法

压力法

扩散法电动进样当把毛细管的进样端插入样品溶液并加上电场时，组分就会因电迁移和电渗作用而进入管内。电动进样的控制参数是电场强度E和进样时间t。电场强度E取值多在1～60kv/60cm之间；进样时间通常在1～10s之间，有时可达1min或更大。优点：电动进样对毛细管内的填充介质没有特殊限制，属普适性方法，可实现自动化操作。缺点：电动进样对离子组分存在偏向，电迁移速度快的进样多，电迁移速度小的少进甚至不进，这会降低分析的准确性和可靠性。压力进样也称流动进样，它要求毛细管中的填充介质具有流动性。当毛细管两端置于不同的压力环境中时，管中溶液即能流动，将样品带入。可用三种方法产生进样动力：正压、负压（管尾抽吸）、重力（虹吸）。采用压缩空气（气体钢瓶）可实现正压进样，并可与毛细管清洗系统共用，多为商品仪器采用。优点：压力进样没有偏向问题，缺点：选择性差，样品及其背景同时被引入管中，对后续分离可能产生影响。扩散进样利用浓度差扩散原理，当将毛细管插入样品溶液时，样品分子因在管口界面存在浓度差而向管内扩散。扩散进样动力属不可控制参数，进样量仅由扩散时间控制。对于利用电动和压力进样的系统，设置电场或压力差为零，即可实现扩散进样。扩散进样时间一般在10～60s。扩散进样对管内介质没有任何限制，属普适性进样方法。扩散进样具有双向性，在样品分子进入毛细管的同时，区带中的背景物质也向管外扩散，由此可得到畸变程度较小（和背景差别不大）的初始区带，能抑制背景干扰，提高分辨率。扩散与电迁移速度和方向无关，可抑制进样偏向，提高定性定