天然产物分离材料

常用的天然产物分离材料Chinapharmaceuticaluniversity主要内容硅胶聚酰胺MCI凝胶大孔树脂Chinapharmaceuticaluniversity一、硅胶硅胶的组成

硅胶(Silica

Gel)的化学成分是二氧化硅。用作分离介质的硅胶是人工合成的多孔二氧化硅，它的特点是其表面含有硅醇基，这是硅胶可以进行表面化学键合的基础。它是一种具有丰富微孔结构，高比表面积、高纯度、高活性的优质吸附材料。Chinapharmaceuticaluniversity硅胶的分类1.按颗粒大小

通用的分析型硅胶基质的直径为5-10μm

高效制备型硅胶，其直径多为20-40μm2.正反相硅胶正相柱大多以硅胶为柱填料或是在硅胶表面键合-CN,-NH3等官能团的键合相硅胶柱。反相柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的键合相。如键合十八烷基（ODS）称为C18柱。其它常用的反相柱还有C8,C4,C2和苯基柱等。Chinapharmaceuticaluniversity3.按含水量根据其吸水量将硅胶分为五级：0%为一级，5%为二级，15%为三级，25%为四级，38%为五级。五级的含水量最高，此时相当于分配层析。适用于极性比较大的生物碱、酚类化合物、有机酸、糖类和氨基酸等成分。Chinapharmaceuticaluniversity硅胶的性质

硅胶无毒、无味，化学性质比较稳定。除氢氟酸和强碱外，不溶于水及各种化学溶剂，物性非常稳定。具有较高机械强度，对液相和气相介质有很强的吸附性能。 ●硅胶适用PH范围：pH

1～8

Chinapharmaceuticaluniversity1、正相硅胶硅胶吸附剂是粉末状多孔固体，其起到氢键吸附作用的基团是硅醇基上的羟基（吸附中心），这些羟基所处的形态不同，其吸附能力也不同。Chinapharmaceuticaluniversity作用原理硅胶的使用1.称量：根据上样量确定通常，称取上样量30-70倍的硅胶；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。Chinapharmaceuticaluniversity2.装柱：（1）湿法：硅胶与同体积的溶剂混合，用玻璃棒充分搅拌。将柱底用棉花塞紧，加入约1/3体积洗脱剂，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入柱内。用洗脱剂将其压实（加入更多的洗脱剂，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积）。Chinapharmaceuticaluniversity（2）干法：将硅胶连续加入硅胶柱，同时轻轻敲打柱子两侧，直至填入硅胶到合适高度，然后垫实硅胶至硅胶界面不再下降为止。Chinapharmaceuticaluniversity3.上样：（1）湿法：用少量溶剂将样品溶解后，再用胶头滴管沿着层析柱内壁均匀加入。然后用少量溶剂洗涤后，再加入。（2）干法：把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶，拌匀后再挥去溶剂。如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层。上完样后，需加入空白硅胶，保持柱床的平整。Chinapharmaceuticaluniversity最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以用一极性较大的溶剂，但必须少量关于拌样溶剂：如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。

Chinapharmaceuticaluniversity4.过柱和收集:

溶剂系统：根据TLC选择，最初的洗脱剂选用样品的Rf值在0.2左右。极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸Chinapharmaceuticaluniversity收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。5.检测:TLC检测：多使用专用显色剂，也可使用紫外检测。紫外的灵敏度一般比显色剂底1-2个数量级。也可以用HPLC进一步的检测。●硅胶可进行粗分段以及细分。●粗分能够将化合物按极性弱→强的流出顺序分段●细分时，但不适宜极性大化合物的细分，容易对性极性过大的化合物产生死吸附，如酚类，大极性生物碱类。Chinapharmaceuticaluniversity应用举例五味子为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.或华中五味子SchisandrasphenantheraRehd.etWils.的干燥成熟果实。前者习称北五味子，后者习称南五味子。具收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功能。主要有效成分为木脂素类北五味子中提取分离五味子乙素，五味子丙素，五味子酯甲北五味子果实乙醇热回流提取三次乙醇提取物减压回收乙醇浸膏加水混悬，石油醚萃取石油醚部位水层Chinapharmaceuticaluniversity

石油醚部位

上硅胶柱，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱

石油醚-乙酸乙酯=20：1

石油醚-乙酸乙酯=10：1

石油醚-乙酸乙酯=1：1无色结晶无色结晶无色结晶甲醇重结晶甲醇重结晶甲醇重结晶五味子丙素五味子乙素五味子酯甲Chinapharmaceuticaluniversity2.反相硅胶反相硅胶柱填料是在硅胶表面键合非极性基团的键和相。反相柱有C18，C8,C4,C2和苯基柱等。其中C18（Octadecylsilyl，简称ODS）即十八烷基硅烷键合硅胶填料，在反相色谱中发挥着极为重要的作用。Chinapharmaceuticaluniversity作用原理：分配原理：在含水的混合有机溶剂中，溶质在流动相中被溶剂化，与吸附在定相表面的烷基官能团上的弱极性有机溶剂分子进行置换从而构成溶质在固定相和流动相中的平衡。吸附原理：基于疏溶剂理论，见图1.溶剂膜2.键合相3.化合物极性端4.化合物非极性端使用：使用类似于正相硅胶。装柱：仅使用湿法上样：使用洗脱剂溶解湿法上样洗脱系统：甲醇-水系统Chinapharmaceuticaluniversity●ODS分离时化合物按极性强→弱的顺序流出。●ODS常用于细分，适宜分离极性化合物，可对在硅胶薄层板上分离度不好的样品的分离。●ODS也可以用于粗分砍段。二、聚酰胺概述氢键吸附原理双重层析理论聚酰胺的应用聚酰胺应用实例Chinapharmaceuticaluniversity1.概述聚酰胺（polyamide，PA）是由酰胺聚合而成的一类高分子物质，又叫尼龙、锦纶色谱中常用的聚酰胺有：尼龙-6（己内酰胺聚合而成）和尼龙-66（己二酸与己二胺聚合而成）。既亲水又亲脂，性能较好，水溶性物质和脂溶性物质均可分离。锦纶11，1010的亲水性较差，不能使用含水量高的溶剂系统。Chinapharmaceuticaluniversity概述聚酰胺层析可用于黄酮、酚类、有机酸、生物碱、萜类、甾体、苷类、糖类、氨基酸衍生物、核苷类等的化合物的分离，尤其是对黄酮类、酚类、醌类等物质的分离远比其它方法优越。特点：对黄酮等物质的层析是可逆的；分离效果好，可分离极性相近的类似物，其柱层析的样品容量大，适用于制备分离。Chinapharmaceuticaluniversity氢键吸附原理酚、酸的羟基与聚酰胺中羰基形成氢键芳香硝基、醌类化合物的硝基或羟基（醌）与聚酰胺中游离氨基形成氢键。脱吸附通过溶剂分子形成新氢键取代原有氢键而完成。黄酮苷元与苷的分离，用含水溶剂（如甲醇-水）洗脱，苷比苷元先洗脱下来；而采用非极性溶剂洗脱时，结果恰好相反。Chinapharmaceuticaluniversity2.双重层析原理聚酰胺既有非极性的脂肪键，又有极性的酰胺键。当用含水极性溶剂作流动相时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为类似反相分配色谱，所以苷比苷元容易洗脱。当用非极性氯仿-甲醇作为流动相时，聚酰胺则作为极性固定相，其色谱行为类似正相分配色谱，所以苷元比其苷容易洗脱。萜类、甾体、生物碱及糖类等难与其形成氢键的化合物的分离Chinapharmaceuticaluniversity3.聚酰胺的应用聚酰胺柱色谱装柱：是将颗粒状聚酰胺混悬于水中湿法装柱，在用非极性溶剂系统时，则用组分中低极性的溶剂装柱。上样：一般每100ml聚酰胺可上样1.5-2.5g。样品先用洗脱溶剂溶解，浓度20%-30%。若不溶解于洗脱剂，可选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入干淀粉中后将溶剂减压蒸去，湿法装入柱顶。洗脱：洗脱剂常采用水，递增乙醇至浓乙醇液或氯仿、氯仿-甲醇，递增甲醇至纯甲醇洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用稀氨水或稀甲酸胺溶液洗脱，分段收集。Chinapharmaceuticaluniversity再生：使用过的聚酰胺一般用5%NaOH洗涤，然后用水洗。再用10%HOAc洗涤，最后用蒸馏水洗至中性即可。若在各种溶剂系统中加入少量酸或碱，可克服色谱中拖尾现象，使斑点清晰。Chinapharmaceuticaluniversity常用展开系统化合物类别聚酰胺薄膜层析常用展开剂系统黄酮苷元氯仿-甲醇(94:6/96:4);苯-甲醇-丁酮(90:6:4/84:8:8)氯仿-甲醇-丁酮(12:2:1);氯仿-甲醇-甲酸(60:38:2)氯仿-甲醇-吡啶(70:22:8);氯仿-甲醇-苯酚(64:28:8)黄酮苷甲醇-乙酸-水(90:5:5);甲醇-水(4:1);乙醇-水(1:1)丙酮-水(1:1);异丙醇-水(3:2);30%-60%乙酸正丁醇-乙醇-水(1:4:5)；乙酸乙酯-95%乙醇(6:4)氯仿-甲醇(7:3);酚类丙酮-水(1:1);苯-甲醇-乙酸(45:8:4)环己烷-乙酸(93:7);10%乙酸醌类10%乙酸；正己烷-苯-乙酸(4:1:0.5)石油醚-苯-乙酸(10:10:5)糖类乙酸乙酯-甲醇(8:1)正丁醇-丙酮-乙酸-乙酸(6:2:1:1)生物碱环己烷-乙酸乙酯-正丙醇-二甲基胺(30:2.5:0.9:0.1)水-乙醇-二甲基胺(88:12:0.1)甾体、萜类己烷-丙酮(4:1);氯仿-丙酮(4:1)甾体苷甲醇-水-甲酸(60:35:5)乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸(50:20:25:5)氨基酸衍生物苯-乙酸(8:2/9:1);50%乙酸；甲酸-水(1.5:100/1:1)乙酸乙酯-甲醇-乙酸(20:1:1)；氯仿-乙酸(8:2)二甲基甲酰胺-乙酸-水-乙醇(5:10:30:20)

0.05mol/L磷酸钠-乙醇(3:1)影响吸附的因素：分子中羟基的数目、位置溶剂与化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合的能力的大小。如溶剂分子与聚酰胺或化合物形成氢键缔合能力越强，则聚酰胺对化合物的吸附作用将减弱。Chinapharmaceuticaluniversity聚酰胺应用中的问题（1）冲洗速度慢。预先用筛筛去细粉或与硅藻土（1：2）混合物装柱，以及加压或减压冲洗等法予以克服。（2）小分子量的聚酰胺等杂质混入。用5％甲醇或10%盐酸预先洗涤除去。（3）粒度不均匀。装柱前过筛。Chinapharmaceuticaluniversity3.聚酰胺应用实例照山白叶70%乙醇回流提取，加等量水沉淀过夜抽滤，减压浓缩①100ml水分散用②聚酰胺柱120cm×10cm，湿法装柱③水洗至无梫木毒素反应④乙醇-水梯度洗脱10%和30%乙醇部分甲醇重结晶浸膏127.5g50%和95%乙醇部分化合物Ⅰ和Ⅱ硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱制备液相，C18柱，乙腈-1%醋酸梯度洗脱化合物Ⅳ母液蒸干，硅胶柱，氯仿-甲醇梯度洗脱制备液相，C18柱，乙腈-1%醋酸梯度洗脱化合物Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、ⅥChinapharmaceuticaluniversity金丝桃苷杨梅苷槲皮苷槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷山奈酚槲皮素三、MCI-GEL系列MCIGEL分离材料概述MCI-GEL反相填料的特点MCI-GEL反相填料的使用MCI-GEL反相填料应用举例Chinapharmaceuticaluniversity1.概述MCIGEL系列精细分离填料是在三菱化学Diaion和Sepabeads大孔吸附树脂基础上设计的，是聚合物基质的分离填料。主要包括以聚苯乙烯基苯为基体和以甲基丙烯酸酯为基体的各种系列。可用于离子交换色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、以及疏水作用色谱等。MCI-GEL有从4微米到300微米粒径分布的多种产品。Chinapharmaceuticaluniversity分离机制填料应用离子交换树脂柱MCIGELCK/CA和CDR10系列糖、有机酸、氨基酸和核酸MCIProtex系列（包括ProtExDEAE和ProtEx-SP）蛋白质尺寸排阻MCIGELCQP系列蛋白质、水溶性聚合物、生物聚合物MCIGelCKO寡糖MCIGelCQP多肽疏水作用色谱柱MCIGelCQH蛋白质和生物聚合物反相色谱柱MCIGELCHP/CHPMG天然产物、蛋白质和生物聚合物配体交换柱用于光学拆分MCIGELCRS-氨基酸和-羟基羧酸MCI-GEL反相填料MCIGEL®

反相填料所用的聚合物主要包括聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸脂两种基质。Chinapharmaceuticaluniversity2.

MCI-GEL反相填料特点吸附量高、颗粒均匀、机械强度好、稳定性好(pH1-14)、不易破碎、残留物少、预处理方便具有较为均一的疏水表面，可在等度或梯度条件下进行常规反相分离比反相ODS填料便宜，无硅羟基裸露相关问题自行装柱方法简单、重复性高高选择性、无特异性吸附。水溶性和非水溶性成分的分离均可使用。Chinapharmaceuticaluniversity3.MCI-GEL反相填料的使用1)

将色谱填料浸泡在甲醇，乙醇或丙酮中。2)

充分搅拌成匀浆装柱，用选定的溶剂冲洗压缩柱床层。3)

用多倍柱体积的上述溶剂冲洗柱，直至填料中的交联剂洗脱干净。4)

用选定的洗脱液平衡色谱柱，备用。5）流动相选择：适用于所有乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等以及所有酸、碱、盐配比的水溶液。ChinapharmaceuticaluniversityMCI的再生：一般可用甲醇再生，若柱子上保留较多，可用乙腈、丙酮等洗脱再生，特殊情况下可以考虑用1mol/L的盐酸或1mol/L的NaOH溶液洗脱，最后用水冲洗到中性即可。Chinapharmaceuticaluniversity使用经验在水较多的情况下，MCI颗粒可能会漂浮，故建议装柱时最好用有机溶剂。

层析流动相选择可以将RP-18或反相TLC的条件中有机相浓度提高10%-15%即可。由于大部分的叶绿素具有较强的疏水性，MCIGEL装填柱在脱除叶绿素等色素方面有非常好的效果。样品的水溶性差，尽可能使含醇量高的洗脱液ChinapharmaceuticaluniversityMCIGEL填装柱的处理虽然较RP-18容易的多，但比起大孔树脂如DA-101来说要麻烦一些。所以如果粗提物能够先用大孔树脂等颗粒较大的材料脱除叶绿素等水溶性较小的各类物质（比如直接用85％的甲醇水溶液洗脱，脱除色素以及氧化度很小的三萜或甾体，合并洗液并浓缩后再上MCIGEL填装柱进行分离），分离效果将会好的多。Chinapharmaceuticaluniversity乌药茎粗粉(8.0kg)

①60%丙酮-水冷浸②减压浓缩混悬液石油醚(脱脂)

水层溶液冷冻干燥冻干粉①乙醇溶解②SephadexLH-20

用乙醇洗脱

组分A组分B组分C组分D

①MCI-gelCHP20P①MCI-gelCHP20P①MCI-gelCHP20P(甲醇-水