第一章紫外-可见分光光度法

第一篇光学仪器分析技术

根据物质发射的电磁波或物质与电磁波的相互作用建立起来的分析方法统称为光学分析法优点：灵敏度高、选择性好、用途广；一般光学分析方法：折光、旋光、浊度法、圆二色谱法

光谱法：紫外可见、红外、荧光、原子吸收、核磁共振第一章紫外-可见分光光度法

ultraviolet-visiblespectrophotometry远紫外（真空紫外）（10-200nm）*近紫外（200-400nm）*可见光（400-760nm）紫外－可见分光光度法根据物质分子中价电子对波长为200~760nm的电磁辐射的吸收特性建立起来的定性、定量和结构分析的方法。属于电子光谱。特点：规律性强、重现性好、灵敏度高。

10-6~10-4g/ml，部分可达10-7g/ml应用：①定性②定量③推断结构一紫外-可见分光光度法的基本原理和概念二紫外－可见分光光度计的基本结构三应用实例§1.紫外-可见分光光度法的基本原理和概念一、分子吸收光谱电子跃迁类型二、紫外－可见吸收光谱中的常用术语

三、吸收光谱

四、Lambert-Beer定律五、偏离L-B定律的因素分子吸收光谱的形成过程：运动的分子外层电子--------吸收外来辐射------产生电子能级跃迁-----分子吸收光谱。能级组成：除了电子能级(Electronenergylevel)的跃迁外，分子吸收能量将伴随着分子的振动(Vibration)和转动(Rotation)能级的跃迁！分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和：不同物质将选择性地吸收不同波长或能量的外来辐射，这是UV-Vis定性分析的基础。定性分析具体做法根据吸收曲线的特性(峰强度、位置及数目等)研究分子结构。分子中的价电子：电子、电子和n电子轨道：几率分布成键轨道、；反键轨道*、*非键轨道n

当两个原子靠近结合成分子时，两个原子的原子轨道以线性组合而生成的两个分子轨道。紫外-可见吸收光谱就是分子中的价电子在不同的分子轨道之间跃迁而产生的一、分子吸收光谱的电子跃迁类型各轨道能级高低顺序：

n**；H2的成键和反键轨道在紫外-可见光区范围内，有机化合物的吸收光谱主要有-*；n-*；-*；n-*及电荷迁移跃迁产生；*>n*>*>n**跃迁：分子中的成键电子跃迁到*反键轨道上去，这是一切饱和有机化合物都可能产生的电子跃迁类型。n*跃迁：分子中未成键的n电子激发到*轨道上去，所有含有杂原子（O、N、S、P、卤素等）的饱和烃衍生物都可发生这种跃迁。含有*、n*跃迁的化合物，如：饱和烷烃、卤代烷烃、醇、醚等是紫外可见吸收光谱测定时的良好溶剂。电子跃迁类型

*跃迁：可以发生在任何具有不饱和键的有机化合物分子中，其最大摩尔吸光系数max很大。n*跃迁：发生在含有杂原子（O、N、S、P、卤素等）的不饱和化合物中，其最大摩尔吸光系数max

比较小。二、常用术语*生色团：分子中可以吸收光子产生电子跃迁的基团。含有键的不饱和基团*助色团：有些基团本身没有生色作用，但却能增强生色团的生色能力，即它们与生色团相连时，会使其吸收带最大吸收波长发生红移，并且增加其强度。通常是带有非键电子对的杂原子的饱和基团，如-OH、-NH2、-OR、-SH、-SR、-Cl、-Br、-I等。*红移和紫移：吸收带的最大吸收波长发生移动，向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为紫移。

用不同波长的光依次透过待测物质，并测量物质对不同波长的光的吸收程度（吸光度A或透光率T），以波长为横坐标，吸收强度参数为纵坐标作图，就可以得到该物质在测量波长范围内的吸收曲线。这种曲线体现了物质对不同波长的光的吸收能力，也称为吸收光谱。三、吸收光谱只有具备共轭基团的物质才能在紫外-可见区产生吸收，但是吸收曲线并不反映非共轭部分的结构。吸收峰：曲线上吸光度最大的地方，它对应的波长称最大吸收波长（max）吸收谷：峰与峰之间吸光度最小的部位，该处的波长称最小吸收波长（min）肩峰：在一个吸收峰旁边产生的一个曲折末端吸收：只在图谱短波端呈现强吸收而不成峰形的部分吸收曲线的形状，最大吸收波长max的位置及吸收强度与分子的结构有关，可对物质进行定性和定量分析。**五、朗伯—比尔定律

光吸收的基本定律和定量测定的依据。**物理意义:当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.用数学表达式为：

A=lg

I0/I=-lgT=ECl吸光系数(E)：物理意义：吸光物质在单位浓度及单位厚度时的A。在一定条件下（单色光、溶剂和温度等），E是物质的特性常数，表明物质对某一波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单色光可有不同的E。E越大，表明该物质的吸光能力越强。测定的灵敏度越高。E值及单位与c的单位有关

当l以cm，c：g/L，E称为吸光系数，用a表示，即：A=aclc：mol/L，E称为摩尔吸光系数，用表示，它比a更为常用，的单位为Lmol-1cm-1，即：A=clc：百分质量浓度g/100mL，E称为比吸光系数或百分吸光系数，用E1cm1%表示

=0.1M

E1cm1%例：M（氯霉素）=323.15g/mol，质量浓度为

2mg/100ml，l=1cm，T=24.3%，求？

吸光度具有加和性：则A总

=Aa

+Ab

+Ac+…。每个组分的吸光度由ci和i决定。吸光度的加和性是计算分光光度法测定混合组分的依据。透光率T与吸光度A的关系

透光率T描述入射光透过溶液的程度T=I/I0

A=lg(I0/I)=lg(1/T)=-lgT

T=10-A=10-ECl

样品吸光度A与c是成正比，A与c的关系是通过原点的一直线。但事实上，A与c并不总是成正比，即偏离L-B定律。这种偏离有化学方面和光学方面的因素。*六、偏离L-B定律

负偏离正偏离CA（一）化学因素：溶液中溶质可因浓度改变而有离解、缔合、与溶剂间的相互作用等原因而发生偏离Beer定律的现象；偏离朗伯－比尔定律的因素

1.非单色光

Beer定律的一个重要前提是入射光是单色光，但事实上用单色器分离出来的光是具有一定波长范围的光。（二）光学因素当E1E2时，则吸光度与浓度是非线性的。二者差别越大，则偏离L-B越大；当E1>E2，测得的吸光度比在“单色光”1处测得的低，产生负偏离；反之，当E1<E2，则产生正偏离。这种影响的程度还与两种光的强度比和检测器对两种光灵敏度的差异等因素有关。所以入射光的谱带宽度将严重影响物质的吸光系数值和吸收光谱形状。分析谱带的选择在所使用的波长范围内，吸光物质的吸光系数变化越大，这种偏离就显著。所以通常选择吸光物质的最大吸收波长作为分析波长。这样不仅能够保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光系数变化不大，对Beer定律的偏离程度就比较小。2.杂散光

从单色器得到的单色光中与所需波长相隔较远的光。3.散射光与反射光使透光强度减弱，吸光度值偏高。4.非平行光使l增大影响测量值由于光源不稳定性、读数不准等带来的误差。由L-B定律微分后得：微分后除以上式可得：

透射光测量误差ΔT是测量中的随机误差，来自仪器的噪音：

1暗噪音：检测器与放大电路等各部件不确定性引起。

2讯号噪音：亦称讯号散粒噪音电子跃迁的不相等性测量光强的不确定性

（三）透光率测量误差T当相对误差c/c

最小时，求得T=0.368或A=0.4343。即当A=0.4343时，误差最小！通常可通过调节溶液浓度或改变光程l来控制A

的读数在0.2~0.7范围内。§2.紫外－可见分光光度计的

基本结构

一、主要部件二、分光光度计的类型和光学性能在UV-vis区可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器光源单色器吸收池检测器显示和处理功能：提供能量激发被测物质分子，使之产生电子光谱谱带（提供宽带辐射）。发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命且发光面较小的光源。连续光源： 紫外光区

氘灯、氢灯（气体放电光源)） 可见光区 钨灯、碘钨灯（热辐射光源）一、主要部件1.光源

功能：将光源发射的复合光（连续光谱）按波长顺序色散，并从中分离出一定宽度的谱带。

①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；

②准光装置：透镜或反射镜使入射光成为平行光束；

③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。

狭缝宽度要适当。2.单色器功能：盛放样品溶液石英（氧化硅）：紫外光区、可见光区玻璃池：可见光区盛空白溶液的吸收池和盛试样溶液的吸收池也应相互匹配，即有相同的厚度和透光性。3.吸收池4.检测器功能：将光信号转变为电信号类型：（1）光电池：硒光电池（可见） 硅光电池（紫外可见）（2）光电管：

紫（蓝）敏光电管铯阴极

红敏光电管银和氧化铯阴极（3）光电倍增管：放大倍数106～107。（4）光二极管阵列检测器：显示方式：T、AC、E5.显示系统二、紫外－可见分光光度计的类型

(1)单波长单光束分光光度计固定波长，分别测量样品、空白对照的T或A，要求光源和检测器供电电压稳定性高缺点：受电源波动的影响较大，误差较大。（2）单波长双光束分光光度计

优点：消除光源强度不稳带来的影响，操作简单，自动记录，快速全波段扫描，不需移动吸收池。仍宜用固定波长测量方式单色光能在很短的时间内交替通过空白和样品溶液（3）双波长分光光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。试样溶液浓度与A成正比。优点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。具有快速扫描的特点（4）光多道二极管阵列检测分光光度计可在0.1秒内获得190～820nm范围的全光光谱。用于追踪化学反应的反应动力学研究。操作简单，只需将样品放入无盖开放式样品室，并点击“开始”即可。MultiSpec-1500型紫外可见光电二极管阵列分光光度计紫外-可见分光光度计使用注意事项1、取吸收池时，手拿毛面。盛装样品溶液以池体积的4/5为宜。使用挥发性溶液时应加盖。吸收池每次放入的方向要相同。使用后用溶剂或水冲洗干净，污染不易洗净时可用硫酸-发烟硝酸（3：1）浸泡。2、含有杂原子的有机溶剂，通过有很强的末端吸收，用作溶剂时，测定波长均不能小于溶剂的截止波长。3、稀释时，所取溶液体积不得少于5ml。含量测定时，常取3份，平行操作。4、除另有规定外，供试品溶液的吸光度在0.2-0.7之间为宜。5、狭缝宽度的选择就以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准。§3.应用实例

吸收光谱比较简单，特征性不强，并且大多数简单官能团在近紫外光区只有微弱吸收或无吸收，所以应用有一定局限性。但可用于鉴定共轭生色团，以此推断未知物的结构骨架，在配合其它结构分析方法时，是有用的辅助方法。一、定性鉴别定性方法对比法 形状、峰数、max位置、强度与相应的

同一物质图谱相同，但图谱相同的不一定是同一物质1.测定max与不同波长处A的比值

2.测定一定波长下的E3.对比不同吸收峰（谷）的A或E的比值可以消除c、l的影响4.对比吸收光谱的一致性P14二、纯度检查杂质检查

化合物无吸收，杂质有强吸收，如乙醇中的苯；化合物有吸收，杂质可使化合物的吸光系数增大或减小；杂质使吸收光谱变形。依据：Lambert-Beer定律，A=Ecl波长：max，提高灵敏度，减少测量误差如有几个峰，选择无其他物质干扰的较高的吸收峰。一般不选靠近短波末端的吸收峰若溶剂在紫外光区有吸收峰，组分测定的波长必须大于溶剂的截止波长。**三、单组分的定量方法（一）标准曲线法（二）对照法（三）吸光系数法（一）标准曲线法

通常采用A—c

标准曲线法定量测定。A=KcK值不再是物质的常数，不能用作定性依据，只是个别具体条件下的比例常数。（二）对照法在同样条件下配制标准溶液和试样溶液，在选定波长处分别测量吸光度，根据朗伯-比尔定律，可以得出：Eg:可测定试样中组分的含量cx弱酸（碱）的离解常数和配合平衡常数及配合物组成的测定。（三）吸光系数法

这种方法也称绝对法注意：此法计算的浓度为百分浓度，即

100ml中所含被测组分的克数，

稀释倍数百分含量例1浓度为25.0μg/50mL的Cu2+溶液，用双环已酮草酰二腙分光光度法测定，于波长600nm处，用2.0cm比色皿测得T=50.1%，求吸光系数a和摩尔吸光系数。已知M(Cu)=64.0。解已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，l=2.0cm,

则根据朗伯—比尔定律

A=αcl，而ε=Mα

=64.0g·mol-1×3.00×10-2L·g-1·cm-1=1.92×104(L·mol-1·cm-1)例2

精密称取咖啡酸10.00mg，加少量乙醇溶解，定容至200ml，取此溶液5.00ml，置于50ml容量瓶中，加6mol/LHCl4ml，加水至刻度。取此溶液于1cm吸收池中，在323nm处测得吸光度为0.463，已知该波长处咖啡酸的=927.9，求咖啡酸的百分含量。99.8%解例3

精密称取50.00mg样品，置于250ml容量瓶中，加入0.02mol/LHCl溶解，稀释刻度。准确吸取2ml，稀释至100ml。以0.02mol/LHCl为空白，在263nm处用1cm吸收池测得透光率为41.7%，其摩尔吸光系数为12000，被测物分子量为100，求263nm处的和样品的百分含量。1200，79.2%解：四、多组分的定量方法

要求：

被测组分彼此不发生反应每组分在某一波长处范围内符合L-B定律

依据：吸光度的加和性三种情况：①x、y两组分共存，吸收光谱不完全重叠②x、y两组分共存，吸收光谱部分重叠③x、y两组分共存，吸收光谱互相重叠①若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。②a，b组分有部分重叠根据吸光度的加合性计算A1a=E1acal③若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。当l=1例4

有一A和B两化合物的混合溶液，已知A在282nm和238nm处的分别为720和270。而B在上述两处波长处的吸光度相等。现把AB混合液盛于1.0cm吸收池中，测得282nm处的吸光度为0.442，238nm处的吸光度为0.278，求A的浓度（mg/100ml）

解

AA=cl

283nm：A1=AA1+AB

238nm：A2=AA2+AB0.364mg/100ml吸收带及其与分子结构的关系R带（基团带）：由ｎ→π*跃迁引起的吸收带(如C=O等)，λmax～300nm，吸收较弱。K带：相当于共轭双键π→π*所产生的吸收峰，ε>104，强带。如丁二烯。B带：是芳香族化合物的特征吸收带，在230～270nm处出现精细结构光谱。E带：是芳香族化合物的特征吸收带，由环状共轭*跃迁产生（强吸收）。E1～180nm（ε为47000）,E2～200nm(ε为7000)苯异丙烷溶液的紫外吸收光谱B结构分析（一）有机化合物的紫外吸收光谱主要决定于分子中生色团和助色团以及它们的共轭情况，不是整个分子的特征（紫外吸收光谱特征）。推定分子的骨架、判断发色团之间的共轭关系和估计共轭体系中取代基的种类、位置和数目1．饱和碳氢化合物