第五章 分子发光分析

第五章分子发光分析分子发光基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。分类：依据激发模式不同光致发光，场致发光，热致发光，化学发光等光致发光：按激发态的类型分

荧光和磷光第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是依据分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。特点：（1）灵敏度高检出限：比分光光度法低2～4个数量级；（2）选择性强既可依据特征发射光谱，又可根据特征激发光谱；（3）试样量少缺点：应用范围较分光光度法小。二、基本原理

(一)分子荧光光谱的产生1.分子能级与电子能级的多重性ππππ*π*π*abc能量单重态和三重态的电子分布图基态S0b.激发单重态Sn2S+1=1c.激发三重态Tn2S+1=3单重态与三重态的区别电子的自旋方向不同三重态的能量稍低于单重态2.荧光的产生

电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁等方式失去能量；

激发态→基态：多种途径和方式(见下页能级图)；速度最快、激发态寿命最短的途径占优势；传递途径辐射跃迁荧光磷光内转移外转移系间窜越振动弛豫非辐射跃迁S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜越内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫振动驰豫在同一电子能级中，电子由高振动能级转至低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。内转移

当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。

通过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。系间窜跃指不同多重态间的无辐射跃迁，例如S1→T1就是一种系间窜跃。

荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1→S0跃迁），发射波长为‘2的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，荧光的发射波长比吸收波长要长；‘2>2>1；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1→S0跃迁）；电子由S0进入T1的可能过程：（S0→T1禁阻跃迁）

S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→T1发光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持续一段时间外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。(二)荧光效率及其影响因素1、荧光效率：又称荧光量子产率，就是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用f表示，f为0~1，即荧光效率越高，辐射跃迁概率就越大，物质发射的荧光也就越强。（1）跃迁类型：*→

的荧光效率高，系间跨跃过程的速率常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移

含→*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强化合物（在环己烷中）φf

λ/nm

苯0.07283联苯0.18316对-联三苯0.933422、荧光与分子结构的关系（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。（4）取代基效应：芳环族化合物苯环上不同取代基对该化合物的荧光强度和荧光光谱有很大的影响，可归为下列几种类型：第一给电子基团使荧光增强-OH、-NH2、-NR2、-OR；第二吸电子基团会减弱甚至破坏荧光-COOH、-NO2；第三卤素等重原子取代基，常导致荧光减弱和磷光增强。第四将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光而减弱荧光；第五双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之，则荧光减弱。3、环境因素对荧光的影响(1)溶剂的影响

由于溶质分子与溶剂分子间的作用，使同一种荧光物质在不同的溶剂中的荧光光谱的位置和强度都会有显著的不同

如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况

溶剂介电常数荧光峰λ/nm荧光效率四氯化碳2.243900.002氯仿5.23980.041丙酮21.54050.055乙腈38.84100.064(2)温度的影响

荧光强度对温度变化敏感，一般来说，溶液的荧光强度随着温度升高而降低。(3)溶液pH

带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物的荧光一般都与溶液的pH有关，因此在荧光分析中要严格控制溶液的pH值。

如苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性溶液中，无荧光再如苯胺在pH7～12溶液中有蓝色荧光，而在pH小于2大于13的溶液中都不发荧光。另外金属离子与有机试剂形成的发光螯合物也受到溶液的pH影响(4)表面活性剂的影响表面活性剂的存在，使得处于激发单重态的的荧光物质分子起到保护作用，减少了非辐射跃迁几率，提高荧光效率。(5)顺磁性物质的影响顺磁性物质的存在，使得处于激发单重态分子向三重态的体系间穿越速率增大，荧光效率降低。如O2。(6)溶液荧光的猝灭荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭。能引起荧光强度降低的物质称为猝灭剂。（1）碰撞猝灭M+hγ—M*,M*+Q—M+热（2）静态猝灭M+Q—MQ非荧光（3）转入三重态的猝灭三重态O2（4）发生电子转移反应的猝灭M+Q—发生电子转移（5）荧光物质的自猝灭荧光物质浓度较高(四)荧光的激发光谱和发射光谱2.荧光(磷光)的发射光谱曲线

固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光与发射光波长关系曲线(图中曲线II)。1.荧光(磷光)的激发光谱曲线

固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线(图中曲线I)。3.激发光谱与发射光谱的关系

a.斯托克斯(Stokes)位移

指激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。

b.发射光谱的形状与激发波长无关

电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级图2,1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如‘2

)。

S2S1S0T1吸收发射荧光发射磷光系间窜跃内转换振动弛豫能量l2l1l

3

外转换l

2T2内转换振动弛豫c.镜像规则

通常荧光发射光谱与激发光谱成镜像对称关系。350荧光激发光谱荧光发射光谱蒽的激发光谱和荧光光谱200250300400450500nm三、荧光分析仪器

测量荧光的仪器主要由五个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器和显示器。特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器光源：氙灯和高压汞灯样品池：石英检测器：光电倍增管。1定量依据

当荧光物质浓度很小时，荧光强度If与荧光物质浓度c之间的关系式为

If=2.3φfI0εbc式中：φf为荧光效率，I0为激发光的强度，ε荧光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程，c为荧光物质的浓度。在一定条件下，φf、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成

If=Kc即荧光强度与荧光物质的浓度c成正比。

荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀（A<0.05）的溶液。对于较浓溶液，会产生浓度猝灭现象。四、定量分析方法2定量分析方法标准曲线法：

配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出未知试样的浓度；比较法：

在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；五、荧光分析法的应用(1)无机化合物的分析

与有机试剂形成配合物后测量；可测量近70多种元素。

配合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使得无荧光或荧光弱的物质转变为强荧光物质。荧光镓pH=5.0,与Al3+→黄绿色荧光物pH=3.0,与Ga3+→黄色荧光物安息香与硼酸盐→绿蓝色荧光物与Zn2+→绿色荧光物碱性介质中罗丹明B+Au3+、Ga3+等与Cl-、Br-等先形成二元络合物三元配合物二元配合物(2)有机化合物的分析

芳香族化合物具有共轭的不饱和结构，多能发生荧光，可以直接进行荧光测定；而脂肪族化合物的分子结构较简单，本身能发荧光的很少，须与某些试剂反应后才能进行分析。如：测定丙三醇芳香族化合物适当的与某些试剂作用后测定可提高灵敏度。第二节磷光分析法磷光是从亚稳的三重态跃迁至基态时所产生的辐射分子磷光分析法是依据分子磷光光谱进行定性，以磷光强度进行定量的一种分析方法。

与荧光相比，磷光具有两个特点（1）磷光辐射的波长比荧光长（2）磷光的寿命比荧光长一、基本原理

1.磷光强度与磷光物质浓度的关系

当磷光物质浓度很小时，磷光强度Ip与磷光物质浓度c之间的关系式为

Ip=2.3φpI0εbc式中：φp为磷光效率，I0为激发光的强度，ε磷光物质的摩尔吸收系数，b为试样池的光程。在一定条件下，φp、I0、ε、b均为常数，所以上式可写成：Ip=Kc

即磷光强度与磷光物质的浓度c成正比。2.温度对磷光强度的影响随着温度的降低，磷光逐渐增强。低温磷光:用液氮作冷却剂3.重原子效应

使用含有重原子的溶剂或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光物质的磷光强度，这种效应称作重原子效应。机理：重原子的高核电荷使得磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。4.室温磷光由于低温磷光需要低温实验装置、溶剂选择的限制，发展了以下几种室温磷光法：（1）固体表面室温磷光法基于测量室温下吸附于固体基质(载体)上的有机化合物所发射的磷光。理想的载体是既能将分析物质牢固地束缚在表面或基质中以增加刚性，并减小三重态的碰撞猝灭等非辐射去活化过程，而本身又不产生磷光背景。（2）胶束增稳的溶液室温磷光法当向溶液中加入适量的表面活性剂，形成胶束，由于胶束的多相性，改变了磷光团的微环境和定向的约束力，从而强烈影响了磷光团的物理性质，减小了内转化和碰撞能量损失等非辐射去活化过程的趋势，明显增加了三重态的稳定性，从而可以实现在溶液中测量室温磷光。二.磷光分析仪和荧光分析仪器基本相似。在荧光分光光度计上配上磷光附件后，即可用于磷光定量。（1）试样室将试样放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，即可用于低温磷光测定。（2）磷光镜有些物质同时会发生荧光和磷光，为了能在同时有荧光现象的体系中测定磷光，通常必须在激发光单色器和液槽之间以及在液槽和发射光单色器之间各装一个斩波片，并由一个同步马达带动，这种装置称作磷光镜。三、磷光分析法的应用

磷光分析法在无机化合物的测定中应用较少，它主要用于测定有机化合物。(1)稠环芳烃分析采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）(2)农药、生物碱、植物生长激素的分析(3)药物分析见下表一、概述化学发光

某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。

化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。化学发光分析

利用某些化学反应所产生的光发射现象而建立的一种分析方法。第三节化学发光分析特点characteristics1.灵敏度极高例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定210-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量。2.线性范围宽一般有5~6个数量级3.分析速度快流动注射化学发光测大于100个样/h4.仪器设备简单无背景光、散射光等干扰；不需要光源、单色器和背景校正；缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。

二、基本原理(一)化学发光反应条件在化学反应过程中，某些反应产物接受化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。A+B=C+D*D*→D+h（1）能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原反应，激发能与反应能相当，E=170～300kJ/mol；发光位于可见光区；（2）反应历程有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态；(二)化学发光效率和发光强度化学效率：发光效率：

化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质，也受环境的影响。发光强度

化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示，它与化学发光反应的速率有关。时刻t的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)：如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内的发光总强度来进行定量分析。(三)化学发光反应的类型（1）气相化学发光反应主要有O3，NO，S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3，NO，NO2，H2S，SO2和CO等。a.一氧化氮与O3的发光反应

NO+O3→NO2*+O2

NO2*→NO2+h发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/cm-3；

b.乙烯与O3的发光反应

乙烯与O3反应，生成激发态甲醛：

CH2O*

→CH2O+h最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1ng/cm-3～1g/cm-3；（2）液相中的化学发光反应

机理研究较多，在分析中应用最多；可测痕量的H2O2、Cu、Mn、Co、V、Fe、Cr、Ce、Hg、Au、Th等。应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）；化学发光反应效率：0.15～0.05；鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程：（1）该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、Fe3+、Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2）可检测低至10-9mol/L的H2O2；（3）间接测定某些生物试样

氨基酸+O2

酮酸+NH3+H2O2

氨基酸氧化酶葡萄糖+O2+H2O葡萄糖酸+H2O2

通过测定生成的H2O2，确定氨基酸、葡萄糖含量。葡萄糖氧化酶二、化学发光分析的仪器装置流程：发光反应室光检测器信号放大器显示与记录

发光反应可采用静态或流动注射的方式进行：

静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合，测最大光强度或总发光强度；试样量小，重复性差；

流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定最大光强度；试样量大；本章小结一.荧光与磷光的产生辐射跃迁：荧光及磷光;非辐射跃迁：振动弛豫，系间窜越，内转换，外转换；激发光谱与发射光谱;荧光量子产率荧光效率与物质分子结构的关系：跃迁类型，共轭效应，刚性平面结构，取代基效应;荧光效率与环境因素的关系：溶剂，温度，pH。二.荧光与磷光分析法仪器结构：两个单色器，光源与检测器成直角定量依据与方法：If=Kc,Ip=Kc应用：定量，有机，无机三.化学发光分析化学发光的产生化学发光效率φcl=φr·φf总发光强度与浓度的关系：A=φcl·c=Kc化学发光装置发光反应室－光检测器－信号放大－显示本章作业：p65-66：1，2，5，7。1.下列哪种去激发过程是分子荧光发射过程？A．分子从第一激发单重态的各振动能级跃迁回基态；B．分子从第一激发单重态的最低振动能级跃迁回基态；C．分子从第一激发三重态的各振动能级跃迁回基态；D．分子从第一激发三重态的最低振动能级跃迁回基态；2.下列说法中，正确的是哪一个？A．能发荧光的物质一般具有杂环化合物的刚性结构；B．能发荧光的物质一般具有大环化合物的刚性结构；C．能发荧光的物质一般具有对称性质的环状结构；D．能发荧光的物质一般具有π－π共轭体系的刚性结构；练习BD3.在下列的四种说法中，哪一种是不正确的？A.分子荧光发射光谱通常与吸收光谱互为镜像关系；B.分子荧光发射光谱与激发波长没有关系；C.分子荧