环境工程微生物学

第七章微生物的生长繁殖及其控制7.1细菌的群体生长7.2基质浓度与微生物比生长速率的关系7.3研究微生物生长的培养方法7.4微生物纯培养物的分离及生长的测定7.5环境因素对微生物生长的影响7.6微生物生长的控制微生物的生长(microbialgrowth)是指微生物吸收营养物经代谢转化为自身细胞成使细胞体积扩大或细胞质量增加的生物学过程。微生物的繁殖(microbialreproduction)系指微生物长到一定阶段，由于细胞结构复制与重建并通过特定方式产生新个体——个体数目增加的生物学过程。生长是一个量变(个体由小到大或由轻到重)的过程；繁殖是一个质变(新生命个体诞生)的过程。微生物群体生长的研究更具有实际意义。7.1细菌的群体生长微生物的群体生长(groupgrowthofmicroorganisms)是指在一定时间内细胞数量的增加。7.1.1细菌的群体生长规律——生长曲线将一定数量的纯种微生物细胞接种于一定体积的液体培养基内，在一定条件下进行培养，以生长时间为横坐标，以细菌数目的对数值（或细胞生物量）为纵坐标绘制的一条曲线称为生长曲线。7.1.1细菌的群体生长规律——生长曲线(1)延迟期延迟期(1agphase)：又叫迟缓期、迟滞期或调整期，是细菌对新环境的适应过程。特点：分裂迟、代谢力强细胞数目不增加，但代谢十分活跃。核酸含量增加，诱导酶大量产生，合成中间产物，细胞体积增长很快，对环境变化较为敏感。(2)对数期对数期(logphase)：又叫指数期或生长旺盛期。特点：细菌的繁殖速度最快，以几何级数增加，即按2n的速度增加。细菌数目的增加与培养时间成正比。细胞活性最大，细胞组分合成非常迅速，细菌生长代谢十分旺盛，菌体有规律地高速繁殖，世代时间最短。有毒代谢物积累很少，对不良因素的抵抗力很强，细胞死亡极少甚至不死亡。(2)对数期（续）单细胞增加一代所需要的时间称为世代时间(G)。已知：t1时细菌数为X1；t2，繁殖n代后的细菌数X2=2nX1，计算世代时间G：G=（t2-t1）/nn=3.3(logX2-logX1)G=（t2-t1）/(3.3logX2/X1)G与培养条件相关如E.coli，培养温度为21.5-21.8℃时，G=62.2min；37℃时，G=17min；超过50℃时便不能生长。(3)稳定期稳定期(stationaryphase)：又叫最高生长期或平衡期。特点：生长率下降并出现部分菌体死亡，繁殖率与死亡率趋于平衡，活菌数保持相对稳定；细菌代谢活力降低，细胞内开始贮藏物质；芽孢细菌的芽孢开始形成。适合于收获大量的菌体。(4)衰亡期衰亡期(declinephase)：又称死亡期。特点：细菌代谢活力大大下降，死亡率明显增加，活菌数迅速减少，甚至按几何级数下降。芽孢细菌已形成芽孢，菌体出现自溶现象(即内源呼吸)，并释放出氨基酸、酶及抗生素等产物；菌体细胞产生畸形，有的革兰染色阳性菌变为革兰阴性菌。7.1.2微生物生长曲线在废水生物处理中的指导作用以培养时间为横坐标，以活性污泥干重为纵坐标绘制的曲线为活性污泥生长曲线；与细菌生长曲线类似；7.1.2微生物生长曲线在废水生物处理中的指导作用（续）还表示为微生物的代谢速率与食料／微生物(质量或浓度)的关系。迟缓期和对数期稳定期衰亡期7.2基质浓度与微生物比生长速率的关系1942年[法]学者莫诺特(Monod)提出；μ——微生物比生长速率，时间-1，即单位生物量的增长速度，x为微生物的浓度；μmax——微生物的最大比生长速率，时间-1；S——基质浓度（质量/容积）Ks——比生长速率为最大比生长速率一半时的基质浓度。7.3研究微生物生长的培养方法7.3.1微生物的分批培养(bathcultureofmicroorganisms)分批培养是将微生物接种到一定体积的液体培养基中，使其在一定条件下生长繁殖的培养方法。特点培养基一次加入不再更换且不予补充。微生物经历了一个细胞数量由少到多直至达到最大数量，而后又从多到少直至衰减死亡的生长过程，序批式间歇曝气(SBR)是分批培养的具体应用。7.3.2微生物的连续培养微生物的连续培养(continuouscultureofmicroorganisms)：在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率增长并能持续生长下去的一种培养方法。恒浊连续培养：控制流速使菌液浊度维持恒定；用于发酵工业。恒化连续培养：控制培养基中某种营养物质的浓度保持恒定，使细菌的比生长速率保持恒定；大部分用于污水生物处理(SBR法除外)。7.4微生物纯培养物的分离及生长的测定7.4.1纯培养物的分离(1)稀释平皿分离法7.4.1纯培养物的分离(2)划线分离：将已灭菌的培养基待溶化后倒入无菌平皿内，凝固后，用接种环沾取少许待分离的样品，在无菌条件下，于培养基表面进行扇形、方格等不同形式的划线，使微生物得以分散，经保温培养一定时间后，可出现单个菌落。照此方法重复划线便可获得纯种。7.4.1纯培养物的分离(2)划线分离：斜线法曲线法方格法放射法四格法7.4.1纯培养物的分离(3)选择分离：利用微生物所需营养物质、环境条件等的差异性，创造条件以达到分离纯种的目的；如若筛选厌氧菌必须创造无氧环境，以限制好氧茵的生长。7.4.2微生物生长的测定7.4.2.1细胞数目的测定(1)平板稀释活菌计数法菌落数即代表样品中的活菌数。使用较广，但存在不足：①从理论上一个菌落是由一个活细胞发育而成的，但事实上有时两个或多个细胞连在一起也形成一个菌落；②有的细菌分裂迟缓或生长缓慢，形成的菌落很小，甚至长出较晚，易漏掉；③由于操作过程中造成的意外损伤，如培养基过热致使细胞死亡等，会带来较大的误差。(2)直接计数测定法在显微镜下用计数器直接计数细胞的方法。血球计数器：计数酵母菌、霉菌孢子、藻类及原生动物等个体较大的微生物；细菌计数片或PotraffHausser计数器：计数细菌等较小的细胞(2)直接计数测定法（续）支持盖玻片的脊从这里加入样品。小心操作避免溢流；在盖玻片与计数板之间有0.02mm的高度；25个大方格，面积1mm2。计算室体积0.02mm3。显微观察计数；计数大方格中的所有细胞，选择几个方格进行计数，最后算平均值。（这里有12个细胞）计算每升样品中的细胞数：12个细胞×25方格×50×103=1.5×107细胞数/mm2细胞数/mm3细胞数/mm3(ml)(2)直接计数测定法（续）涂片显微镜直接计数法：利用涂片面积与视野面积之比来计算出样品中微生物量A、计算视野面积B、在载玻片中部划正方形C、取0.01ml稀释菌液涂片、固定、染色D、观察计数2cm(2)直接计数测定法（续）涂片显微镜直接计数法2cm个/mL=每个视野的平均菌数××

100×稀释倍数涂片面积一个视野面积（3）滤膜过滤计数法将灭菌的滤膜安装于滤器上，取适量水样放入过滤器漏斗内过滤，将过滤面向上放于平板培养基上培养，计算膜上菌落数10-1原液10ml10-110-210-310-410-510-61ml1ml1ml1ml1ml（4）MPN法

MaximumPossibleNumber10-210-310-410-510-63+3+2+1+0+数量指标321，查表得到MPN值（4）MPN法(5)比浊法悬液中细胞浓度与浊度成正比，与透光度成反比。用光电比色计测定菌悬液，以光密度值表示菌液的细胞浓度。滤光片入射光l0含细胞的样品透射光l光电池(测试投射光

l)记录器↓单位分光光度计-光密度（OD）=Logl0/l1、标准曲线的绘制：用一系列已知菌数的菌悬液测定吸光度，作出吸光度-菌数的标准曲线。2、测出未知菌悬液的吸光度，从标准曲线中查出相对应的菌数。注意：待测样品颜色太深或含其它悬浮物较多时，不宜使用此法(5)比浊法（续）细胞数目或干重7.4.2.2细胞物质的测定(1)干物质的测定通常细菌干重约占湿重的1／5～1／4，即lmg干菌体相当于4～5mg湿菌体，约含4×109～5×109个菌体。(2)DNA含量的测定每个细菌平均含DNA8.4×10-6μg，据此，通过DNA含量还可换算出菌体的数量。(3)含氮量的测定蛋白质含氮量为16%，一般细菌中蛋白质含量约为菌体干重的65%，有的仅约为14%。蛋白质总量=含氮量×6.25细胞总量=蛋白质总量÷65%≈蛋白质总量×l.547.5环境因素对微生物生长的影响7.5.1温度最适生长温度是微生物生长繁殖最快的温度；最低生长温度是微生物生长繁殖速度最低的温度，若再低于这个温度微生物则不能生长；最高生长温度是微生物生长繁殖的最高温度界限，高于这个温度，微生物不能进行生长繁殖，甚至趋于解体死亡7.5.1.1不同温度范围的微生物种类低温微生物(psychrophilicmicroorganism)(嗜冷微生物)中温微生物(mesophilicmicroorganism)高温微生物(thermophilicmicroorganism)(嗜热微生物)微生物类型温度范围所处环境最低温度最适温度最高温度低温微生物-5～010～2025～30南北两极、海洋、冷泉、冷库等中温微生物10～2025～3740～50土壤、根际、人体及温血动物高温微生物23～3050～6070～90温泉、堆肥、土表等高温环境7.5.1.2温度对微生物的影响(1)低温对微生物的影响既能抑制微生物又能杀死部分微生物。低温抑制作用的原因是菌体内的水分冻结，无法进行生化反应，甚至有些大分子物质，如酶蛋白、核糖体等因低温导致松散而失活。低温致死微生物的原因是细胞内的水分形成冰晶，使细胞脱水，原生质的胶体状态遭到破坏。冰晶还会对菌体造成物理损伤。低温能降低微生物的代谢活性，因此，低温下可以保藏食品；但低温不能用来消毒和灭菌。(2)高温对微生物的影响当环境温度超过了微生物的最高生长温度时，就会导致微生物死亡，而且随着温度的升高死亡加快。幼龄比老龄菌对高温更为敏感；无芽孢的细菌、霉菌、酵母菌的营养细胞50～65℃l0min便可死亡，100℃几分钟死亡；放线菌的营养细胞75～80℃l0min死亡，抗热性较强；酵母菌和霉菌的孢子70～80℃l0min死亡；细菌芽孢在100℃以下难以致死，超过l00℃时需要十几分钟、几十分钟，甚至几十小时才能死亡。(2)高温对微生物的影响（续）细菌种类湿热灭菌温度／℃致死时间／min煮沸致死时间／min枯草芽孢杆菌1006～l7>60肉毒梭菌120～12110360蜡状芽孢杆菌1006炭疽芽孢杆菌1055～l0几种芽孢杆菌的致死温度和时间(2)高温对微生物的影响（续）

微生物高温致死的原因：①细胞内的酶遇热失活，不能进行正常的代谢；②非酶蛋白和核酸等细胞成分的破坏；③细胞膜中脂类的热溶解使膜出现小孔，细胞内含物泄漏。7.5.2pH值(1)不同微生物要求的pH值微生物种类pH值微生物种类pH值最低

最适最高最低最适最高细菌5.07.0～8.010.0霉菌1.53.0～6.09.0放线菌5.07.5～8.010.0原生动物5.06.5～8.09.0酵母菌3.05.0～6.08.0(2)pH值对微生物的影响导致细胞膜电荷的改变→影响细胞膜对某些离子性化合物的选择透性→影响微生物对营养物质的吸收。直接影响酶的活性。酶活性↓影响环境中营养物的解离状态及所带电荷的性质。因为细菌表面带有负电荷，中性分子易进入细胞，离子化合物难以进入。pH值变化时就会影响某些营养物(如氨、磷酸盐等)的可利用性。(3)由微生物活动引起环境中营养物pH值的改变及调节办法①有些微生物分解糖类物质产生有机酸如丁酸梭菌分解葡萄糖产生丁酸，使pH值降低；②含氮有机物被微生物降解后产生氨等碱性物质，使pH值上升；③细胞选择性吸收离子性物质而引起pH值的改变如以NaNO3作氮源时，NO3-被吸收后，pH值会上升；以（NH4)2SO4作氮源时，NH4+被吸收后，pH值会下降。加pH缓冲剂进行控制pH的变化。7.5.3氧化还原电位好氧微生物：适宜的值为+0.3～+0.4V，0.1V以上进行好氧呼吸，0.1V以下进行无氧发酵。活性污泥系统：+0.2～+0.6V；厌氧消化池以-0.1～-0.2V为宜。好氧微生物，通入空气或投加氧化剂以提高氧化还原电位；培养厌氧微生物时，加入还原性物质以降低氧化还压电位。影响氧化还原电位的因素很多，有氧分压、氢分压、pH值等。基质

黄素蛋白

铁-硫蛋白泛醌细胞色素细胞色素细胞色素还原电位（V）-0.42H27.5.4溶解氧(DO)(1)专性好氧微生物，只有在有氧分子存在的条件下才能正常生活的微生物，称为专性好氧微生物。如污水好氧生物处理的进水BOD5是0.2～0.3g／L，曝气池混合液悬浮固体为2～3g／L时，溶解氧维持在3～4mg／L为宜。(2)专性厌氧微生物只有在无氧条件下才能生长的微生物称为专性厌氧微生物。专性厌氧微生物只有脱氢酶系统，分子氧对它们具有致死作用，其原因是：①当环境中有氧时，从基质脱下的氢还原NAD产生NADH2，NADH2与O2直接作用生成H2O2；②O2分子直接进入菌体后可转化成游离的O2-。H2O2和O2-均有强烈的毒害作用而专性厌氧微生物恰又缺乏清除H2O2的过氧化氢酶和破坏O2-的氧化物歧化酶，因而中毒死亡。(3)兼性好氧微生物既能在有氧条件下生活，又能在无氧条件下生活的微生物，称为兼性好氧微生物或称为兼性厌氧微生物。这类微生物具有氧化酶和脱氢酶系统。有氧时，氧化酶系统工作；无氧时，氧化酶系统变钝，脱氢酶系统工作。如酵母菌，在有氧情况下，将葡萄糖彻底氧化成CO2和H2O；在无氧情况下，发酵葡萄糖产生大量的乙醇。7.5.5重金属及其化合物有些重金属微生物生命活动不可缺少的成分，有的参与酶的组成，有的是细胞的结构成分。当环境中金属离子浓度比较高时，就会对微生物产生抑制作用。有些重金属不是微生物所需要的，只要存在，对微生物就产生不利影响。7.6微生物生长的控制7.6.1物理方法的控制7.6.1.1高温灭茵消毒灭菌是指将所有微生物(包括芽孢)全部彻底消灭的物理或化学方法；消毒是指杀死全部病原微生物(主要是营养细胞)的物理或化学方法。7.6.1.1高温灭茵消毒(1)高温灭菌法①湿热灭菌在相同温度下湿热比干热杀菌效果好因蛋白质含水量越多，其凝固温度越低。因此，湿热中菌体吸收水分，蛋白质易凝固湿热的穿透力和热传导力比干热大湿热蒸汽存有潜热，蒸汽变为液体时放出的潜热能迅速提高灭菌物体的温度，从而增加灭菌；7.6.1.1高温灭茵消毒（续）高压蒸汽灭菌法：是将待灭菌的物品放在一个密闭的高压蒸汽锅内，加热后，高压锅隔套间的水沸腾产生大量的蒸汽，待水蒸气急剧地将锅内冷空气自排气阀中驱尽后，将排气阀关闭，继续加热，锅内充满饱和蒸汽。7.6.1.1高温灭茵消毒（续）间歇灭菌：是用流通蒸汽反复几次处理的灭菌方法，适用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基(如含糖培养基)等。将物品置于阿诺氏灭菌器、蒸锅或蒸笼中，常压下100℃灭菌15～30min，可杀死营养细胞；冷却后，置于28～37℃保温过夜，使未杀死的芽孢萌发成营养体；再以同样的方法加热处理。如此反复三次，可杀死全部芽孢及营养细胞。7.6.1.1高温灭茵消毒（续）干热灭菌将待灭菌的物品(主要是接种环和接种针等)在火焰上直接灼烧以杀死菌体，此法灭菌彻底；在烘干箱中利用热空气对金属器皿、玻璃器皿等耐热物品进行灭菌，一般将温度调到l60℃，灭菌l～2h。7.6.1.1高温灭茵消毒（续）加热消毒法，物品煮沸l5min以上可杀死细菌所有的营养细胞和部分芽孢。若延长煮沸时间，并在水中加入l%碳酸钠或2%～5%石炭酸，效果更佳。7.6.1.2干燥干燥会使细胞休眠状态。干燥对微生物产生的影响与微生物的种类有关。酵母菌干燥时可存活数月；产荚膜菌、芽孢杆菌、真菌的孢子抗干燥能力很强，可存活数月至数年；而有些微生物，如淋病球菌、醋酸菌对干燥敏感，很快就会死亡。干燥对微生物的影响还与环境中营养物、氧气、温度等有关。7.6.1.3辐射通过空间传递的能量称为辐射。不同波长辐射与杀菌作用的关系260nm7.6.1.3辐射（续）紫外线的杀菌机理：①蛋白质在280nm处有强烈的吸收，辐射能影响酶和蛋白质的合成，影响正常代谢；②在有氧情况下，微生物经紫外线的作用可产生H2O2，由于的强氧化作用，导致细胞死亡；③核酸在260nm处对紫外线的吸收很强，可引起核酸结构的改变，产生致死作用。其中，核酸中嘧啶碱基比嘌呤对紫外线更敏感，易形成胸腺嘧啶二聚体(T-T)，使双链DNA不能正常复制，导致细胞死亡。7.6.1.4渗透压(1)在等渗溶液中，微生物正常生长、繁殖。微生物实验中或注射用的0.85%的生理盐水即等渗盐水。(2)在低渗溶液中，菌体因吸收水分而膨胀甚至破裂；(3)在高渗溶液中，造成质壁分离，微生物停止代谢或死亡。人们常利用高渗透压溶液，如高浓度的盐或糖保存食品。盐的浓度一般为10%～15%，糖的浓度为50%～70%。7.6.2化学方法的控制7.6.2.1无机化合物碱具有杀菌作用。G-细菌比G+细菌敏感；KOH，NaOH，Na2CO3是常用的碱类杀菌剂。利用30%的NaOH溶液处理l0min，即可杀死芽孢；消灭细菌营养体可采用2%～4%NaOH的溶液；Na2CO3杀菌力很弱，主要用作辅助消毒剂。7.6.2化学方法的控制7.6.2.1无机化合物硫酸铜是杀藻剂每升水投加0.3～0.5mg，多数藻类几天内便被杀死。测定DO时，常加入0.1%～l%硫酸铜抑制微生物的呼吸。二氯化汞是常用的消毒剂(1:500)～(1:2000)的升汞溶液对多数细菌有致死作用。银、铅等对微生物都有杀伤作用0.1%～l%硝酸银用于皮肤消毒用0.1%～0.5%的铅盐溶液浸泡微生物几分钟内即可死亡。7.6.2.2有机化合物(1)醇醇是脱水剂，可使蛋白质脱水变性醇是脂溶剂，能溶解细胞膜上的脂类而损伤细胞膜。醇的杀菌力随分子量的增加而增加，即甲醇<乙醇<丙醇<丁醇<戊醇……。乙醇常用作消毒剂。70%的乙醇杀菌效果最好，过高或过低均无作用。无水乙醇起不到杀菌作用。乙醇可用于微生物实验室一些用具，如载玻片、玻棒的消毒。7.6.2.2有机化合物（续）(2)酚(石炭酸)酚具有表面活性剂的作用，可破坏细胞膜，使细胞内容物溢出其主要作用是引起蛋白质变性。

酚的浓度／%

作用

酚的浓度／%

作用0.1抑制细菌生长3.0～5.0几分钟杀死细菌0.5～1.0皮肤消毒5.0喷雾消毒空气1.020min内杀死细菌不同浓度酚的杀菌作用7.6.2.2有机化合物（续）(2)酚甲酚的杀菌力是酚的几倍，甲酚与肥皂的混合液——来苏儿具有很好的消毒效果。3%～5%的溶液可用于桌面、皮肤等的消毒。(3)甲醛市售的福尔马林，即37%～40%的甲醛溶液，具有很好的杀菌作用，通常用l0%的溶液熏蒸消毒无菌室、厂房等。(4)染料结晶紫l／200000～1／300000对G+细菌有抑制作用，而对G-细菌需浓缩十倍才有抑制效应；1／100000浓度的孔雀绿可抑制金黄色葡萄球菌(G+)，而l／30000的可抑制大肠杆菌(G-)。7.6.2.2有机化合物（续）(5)表面活性剂降低溶液表面张力的物质叫表面活性剂，即去垢剂。能吸附于菌体表面，改变细胞壁的通透性，造成细胞内物质多泄，致菌体死亡。阳离子表面活性剂(如新洁尔灭)：可作用于几乎所有的微生物，效力较高，无刺激，一般用于皮肤、机械等的消毒；阴离子表面活性剂(如肥皂、十二碳硫酸钠)肥皂是温和的杀菌剂，只对少数细菌，如肺炎球菌和链球菌有效，而对G-细菌、芽孢、葡萄球菌等均无效十二碳硫酸钠是很好的杀菌剂，特别是对致病性球菌作用更显著7.6.2.3抗生素的影响抗生素系指由微生物、动植物产生的或用化学法合成的、对特异微生物的生长有抑铡杀灭作用的化合物。抗生素具有选择性，即抗生素的作用对象有一定的范围，这种作用范围称为抗生素的“抗菌谱”。只对少数细菌有作用的(如青霉素只作用于G+细菌)称为窄谱抗生素；既对G+细菌又对G-细菌有作用的称为广谱抗生素抗生素