第十一章 疱疹病毒科(Herpesviridae)

PAGEPAGE12第十一章疱疹病毒科（Herpesviridae）疱疹病毒是一群较大的包有囊膜的双链DNA病毒，现已分离到的本科成员至少在80个种以上。它可以感染人和许多动物包括哺乳类动物、鱼、蛙、啮齿动物、鸟、有袋目动物，甚至有可能包括软体动物和真菌。这类病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织，初次感染后，常可造成潜伏状态，并反复发作，可达多年甚至终生。某些疱疹病毒可能是动物和禽类肿瘤的病原因子，其中马立克氏病病毒是已经确认的首例，医学上也开始注意到某些疱疹病毒可能与人的癌症有关。由于疱疹病毒的广泛致病性及在潜伏感染和致癌方面的作用，这类病毒已引起病毒学者的普遍重视。第一节疱疹病毒的一般特征一、疱疹病毒的分类疱疹病毒科下分甲型疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、乙型疱疹病毒亚科（Betaherpesvirinae）和丙型疱疹病毒亚科（Gammaherpesvirinae）。（一）甲型疱疹病毒亚科该亚科包含单纯疱疹病毒属（Simplexvirus）和水痘病毒属（Varicellavirus）两个属。在这两属中主要的病毒有：1．单纯疱疹病毒属：有人疱疹病毒1型（单纯疱疹病毒1型）〔Humanherpesvirus1（HerpessimplexvirustypeI）〕、人疱疹病毒2型（单纯疱疹病毒2型）和羊疱疹病毒2（bovineherpesvirus2），另外，cercopithecine疱疹病毒是可能的种。2．水痘病毒属：有伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus）、水痘-带状疱疹病毒（人疱疹病毒3型）、马鼻肺炎病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、马疱疹病毒1型（马流产病毒）、马疱疹病毒3型（交媾疹病毒）、猫疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒1型、传染性喉气管炎病毒等。（二）乙型疱疹病毒亚科本亚科包含巨细胞病毒属（Cytomegalovirus）和鼠巨细胞病毒属（Muromegalovirus）两个属。该两属中的重要病毒有：1．巨细胞病毒属：有人疱疹病毒5型（巨细胞病毒）、马巨细胞病毒（马疱疹病毒2型）、猪巨细胞病毒等。2．鼠巨细胞病毒属：有小鼠巨细胞病毒（鼠疱疹病毒1型）、大鼠巨细胞病毒（大鼠疱疹病毒2型）、豚鼠巨细胞病毒（豚鼠疱疹病毒1型）等。（三）丙型疱疹病毒亚科本亚科包含淋巴滤泡病毒属（Lymphocryptovirus）和蛛猴疱疹病毒属（Rhadinovirus）两个属，主要的种有：1．淋巴滤泡病毒属：有人疱疹病毒4型（EB病毒）、鸡疱疹病毒2型（马立克氏病病毒）、火鸡疱疹病毒（火鸡疱疹病毒1型）、兔疱疹病毒1型、恶性卡他热病毒（牛疱疹病毒3型）等。2．蛛猴疱疹病毒属：有蛛猴疱疹病毒2型等。疱疹病毒各亚科的主要生物学特征特征αβγ在细胞培养上病毒繁殖速度和传播快较慢不同细胞致病变作用杀死感染细胞作用慢，细胞先胀大而后被杀死不同宿主范围不同较窄较窄隐性感染可以在神经节潜伏在不同组织引起隐性感染常侵犯淋巴细胞和淋巴样母细胞导致隐性感染二、疱疹病毒毒粒的一般特征（一）形态与结构疱疹病毒系球形带囊膜的较大病毒，直径为200～300nm，重约1000～2000Md，在CsCl中的浮密度为1.20～1.29g/cm3。主要由核芯、衣壳、壳皮和囊膜4个结构成分所组成。核芯由双股线状DNA与蛋白质形成的纤维卷轴组成，超薄切片可见为均匀一致的圆形电子致密区，但有时看到花纹样结构，其纤维的末端固定于衣壳下侧。核芯的直径为30～70nm。衣壳直径为100～110nm，有162个壳粒，排列成20面体，衣壳可能由三层组成，中层和内层系无特定形态的蛋白质薄膜，外层是由162个互相连接呈放射状排列具有中空轴孔的壳粒构成，壳粒的大小约12.5×9.5nm。衣壳的周围常有一层无定形的球状物质所覆盖称为壳皮（Tegument），或称皮层，在负染色标本中常呈纤维样，不同疱疹病毒的皮层厚度不同，即使在同一细胞内增殖的病毒粒子的皮层厚度也不一样。再外层为类脂双层膜的囊膜，至少由两层以上的结构组成，其质柔软，厚薄不匀称，上有短的突起，但对其构造和排列情况以及功能等，尚无所知。（二）化学组成疱疹病毒的DNA为双股线状，分子量为85～150Md，其中带状疱疹病毒DNA最小，为85Md，而巨细胞病毒DNA最大，为150Md。大多数疱疹病毒的鸟嘌呤和胞嘧啶（G+C）含量较高，两者之和常在55%以上，其中最高的如牛鼻气管炎病毒和伪狂犬病病毒，达72%。线状双股DNA中有末端重复序列和内部重复序列，其重复序列的数量和长度在不同的疱疹病毒中也有较大差异。疱疹病毒DNA链中有缺口，所以碱变性以后可使DNA变小和呈现不均一性。其线状DNA通过互补区也可以环化。疱疹病毒毒粒中至少有33种蛋白，分子量为15～275Kd，其中6～8种位于囊膜。在受染细胞中可以检出大约20种病毒特异性蛋白，后者不构成毒粒的成分。大约一半的蛋白是糖蛋白，有些是磷酸化的，至少有6个磷酸化蛋白质。衣壳中含有157、55、36和25Kd4种蛋白质。分离的病毒DNA也有感染性，但不能完全排除混有蛋白分子。无囊膜的核衣壳更具有感染性，但仍比完整毒粒为小。核衣壳是主要的细胞内颗粒，壳皮和外膜是它通过核膜和/或浆膜时获得的。第二节疱疹病毒基因组结构的特点一、异构体结构多数疱疹病毒的基因组由两个互相连接的长节段（L）和短节段（S）DNA所组成，有的疱疹病毒其S、L节段可颠倒排列，如HSV（单纯疱疹病毒），因而可以形成4种异构体：P（原型）；IS（S节段颠倒）；IL（L节段颠倒）和ISl（S和L节段均倒置）。在疱疹病毒科中，其病毒基因组的大小和结构有相当大的差异。目前已知有7种不同的疱疹病毒基因组结构形式，其中人类疱疹病毒有4种。松鼠猴疱疹病毒DNA是HSV以外研究得较为详尽的病毒。它的基因组结构很独特，其L节段长约100kb，G+C含量低，在其两侧通过30个拷贝的约1kb的串联重复，高G+C含量序列（H）的部分环状变换排列而连接起来。在马流产病毒（EAV）和伪狂犬病病毒（PRV），只有S倒置重复序列，在L节段未发现有倒置重复序列，并固定在一个方向。在海峡鲇鱼病毒（CCV），其基因组较小（120kb），也发现有的大的直接末端重复序列为其基因组结构的特点。但东半球猴CMV（巨细胞病毒）以及马和小鼠CMVDNA（220kb）是一种无倒置序列结构、缺少L和S节段的线状分子，EBV（EB病毒）DNA则是一种无倒置序列结构的线状分子，其内部串联重复区（IR）都向着分子的一端。综上所述，疱疹病毒基因组的结构，从进化的角度来说，最古老、原始的脊椎动物疱疹病毒是CCV和Lucke蛙瘤病毒，后者只有单一的末端直接重复序列。在鸟和哺乳类动物的非嗜淋巴属的疱疹病毒则发展成L和S倒置重复结构，如HSV、MDV（马立克氏病毒）以及西半球猴CMV；缺少L节段倒置的变种有VZV（水痘-带状疱疹病毒）、PRV（伪狂犬病病毒），EAV（马流产病毒）等；两套倒置均丢失的变种有东半球猴CMV，还可能包括树鼩的疱疹病毒。在一种东半球CMV的基因组中，其内部倒置重复区被从细胞来源的CA重复序列所替代。另一方面嗜淋巴性的疱疹病毒则发展成大套的内部直接重复序列，如人和东半球猴的EBV样病毒；或外侧直接重复序列，如西半球猴松鼠猴疱疹病毒和H.ateles；或内部和外侧都有，如美洲兔的H.sylvilagus。在目前所研究过的疱疹病毒中，其基因组的一个末端或两个末端有不均一现象，这主要是由于串联重复序列拷贝数不同所造成的。二、基因组内部串联重复序列各自疱疹病毒基因组，除上述在大范围的结构上有差异之外，在内部的序列结构上也有差异，特别是串联重复序列结构有很大的不同。这些内部重复序列G+C含量很高，有些还是在编码区；有些是细胞-病毒DNA的同源位点。三、基因组末端结构早在1975年就发现HSV基因组的末端有直接重复序列，称为“a”区。DNA序列分析表明，HSV1的“a”区为400bp，而HSV2则为250bp。不同HSV1毒株“a”区大小的变异与内部短串联重复序列的数目有关，HSV1和HSV2的“a”区很少同源性。“a”区是由短的直接重复序列单元（20bp）所构成，其数目的多少引起HSVL节段内末端和外末端的不均一性。HCMV（人巨细胞病毒）DNAL节段的内末端有比HSV大的类似的结构（～800bp）。S节段的外末端也因重复序列数目的不同而呈不均一性。但是，小鼠CMV的线状基因组仅含一短的30bp的直接重复序列。VZV（水痘-带状疱疹病毒）DNA序列分析却表明其L节段末端有-88bp的倒置重复序列，S节段末端有一长的倒置重复序列，为7319bp。EBV的DNA末端也是不均一的，有多至5个550bp序列的差异，随机分布在其线状DNA的两个外侧末端。几乎所有疱疹病毒DNA的一个末端都含有一组28bp的保守序列：CCCCGGGGGGG-TGTTTTTGATGGGGGGG。至于从复制型的HSVDNA切割并包装成成熟HSVDNA分子的信号，其本质及精确的定位尚不清楚，但有可能在a区。这一功能是造成L和S倒置形成异构体的根本机制。四、不同疱疹病毒基因组的比较人类5种主要的疱疹病毒基因组的全序列测定即将完成，届时可以得到这几种疱疹病毒基因组结构比较的精确资料，目前的资料是零星的。HSV1和HSV2在核苷酸水平上有50%的同源性，而酶谱分析研究表明，两种DNA分子在物理结构上是十分相似的，尽管HSV2的US区比HSV1（MP）的约长3kb。两种DNA分子同源性较差的区段位于G+C丰富的L和S节段的倒置重复区。与HSV最接近的动物疱疹病毒是牛乳腺炎病毒（BMV），它与HSV的同源性分布于整个基因组，它不同于其它许多动物疱疹病毒，仍保留其倒置L节段的结构。严格条件下的杂交试验表明，HSV与关系较远的动物疱疹病毒的基因组序列的保守区，位于L节段的中部，特别是HSV1DNA的DNA多聚酶/主要DNA结合蛋白区段。对各种疱疹病毒基因组比较认为，各种疱疹病毒基因组之间，一方面在结构和某些基因序列之间有一定的同源性，另一方面，确也有相当的不同。例如EBV的EBNA1、2、3，BamHIM区的可为丁酸钠诱导的两个早期核抗原，在HSV中尚未发现有上述类似的基因产物。第三节基因转录与调节一、HSVHSV1基因组的全序列已经测定，共152260bp，可分为UL、US、TRL、TRS、IRL和IRS各区段。UL有56个功能片段，US有12个功能片段。HSV1全基因组G+C%为68.3%，目前可以识别的基因数为72个，编码70个不同的蛋白。美国芝加哥的Roizman首先把HSV的基因转录分为三类，即α、β、γ；同时在英国Glasgow的Subak-Sharp则分为IE（立即早期）、DE（早期或晚早期）和L（晚期）三类。早期基因转录是指DNA复制之前的转录，晚期基因转录是指或是在绝对依赖于DNA的复制（γ-2或真正的晚期），或者虽然在DNA复制前就开始合成，但在DNA复制后大量增加（γ-1，β/γ，准晚期或早/晚期）。IE（α）mRNA的合成不需要任何病毒基因产物，而DE（β）mRNA的合成则需IE蛋白的合成才能进行。α基因大约占基因组的10%，主要集中在倒置重复序列区段，但是一般来说，早期或晚期基因是随机分布在全基因组的，有60多个转录物。α基因有5个，即α0、α4、α22、α27和α47，随后的基因有β1、β2、γ1和γ2，这都需要α基因的产物才能转录，特别是α4基因的产物，α4是主要的反式激活的调节蛋白。α0的全基因位于L节段的重复区，α4的全基因则位于S节段的重复区，α22和α47基因则位于S节段重复区与独特区的交界处，α27基因则位于独特区，但仍接近于L节段重复区与独特区的交界处。所有的HSVα基因产物除α47之外，均是磷酸化的核蛋白。HSV1VF65基因编码的蛋白，脯氨酸十分丰富，也是一种磷酸化的核蛋白，与以前所知的调节蛋白无同源性。VF65蛋白可从受染的细胞中或病毒毒粒中提取，它能激活HSV立即早期启动子。由于没有DNA结合性质，它通过与细胞因子的相互作用，结合于TAATGARAT序列上才发挥启动子激活作用。另一个HSV基因转录的调节蛋白是128Kd的DNA结合蛋白，后者对病毒DNA的复制以及对晚期多肽的合成和维持在正常水平是必需的，它是DE产物，非磷酸化蛋白，也结合单链DNA，也对早期基因的表达起作用。二、VZVVZV基因组全序列已经测定，全长124884bp，G+C含量为46.02%，其中UL共104836bp，G+C为44.33%；Trl和IRL各为88.5bp，G+C为68.3%；US共5232bp，G+C为42.7%；TRS和IRS各为7319.5bp，G+C为59.04%。根据DNA序列推导的功能片段有71个，其中许多终止于AATAAA或ATTAAA序列附近。疱疹病毒基因中含内含子的并不普遍，HSV1基因组中只有4个是含有内含子的拼接基因，VZV中ORFs42和45在该病毒表达过程中是可能拼接的，有的基因编码区有部分重叠。第四节疱疹病毒的糖蛋白疱疹病毒的糖蛋白涉及病毒与细胞的互相作用，病毒感染的病理过程、免疫原性以及亚单位疫苗的研制。一、HSV糖蛋白种类在HSV感染的细胞中有6种糖蛋白：Gb、gC、gD、gE、gG和gH，这6种糖蛋白均存在于病毒毒粒中，在HSV2中尚未发现gH-1。二、不同疱疹病毒之间糖蛋白的同源性EBV的DNA全序列已经测定，BXLF2ORF相当于HSV1的gH-1，BALF4ORF相当于HSV的gB，而EBV的gp350和gp220在其它疱疹病毒中尚未找列相对应的。EBV基因组中的BDLF3和BILF2糖蛋白也未检定。关于CMV的gp，用单克隆检定的有gA-F，在gA上至少有5个抗原决定簇。HCMV基因组的HindIIIF片段序列分析表明，此处编码一个糖蛋白与HSV-gB、VZV的gpII和EBV的BALF4有高度同源性。HCMV基因组中的L片段中，又发现了与HSV1gH，EBVBXLF2和VZVgpIII同源的糖蛋白，称CMV-gH。马HSV113gKd糖蛋白，牛乳腺炎病毒120Kd和130Kd糖蛋白与HSV-gB在抗原性和结构上是相关的。三、HSV糖蛋白的功能目前所知HSV糖蛋白的功能有：HSV糖蛋白的功能HSV糖蛋白gBgCgDgEgGgH在组织培养中病毒繁殖所必需+——+在毒粒中存在++++++病毒吸附细胞++++病毒进入细胞++细胞融合（syn）+++细胞间传播+FC受体———+——C3b-受体—+(gG-1)————NK特异性++中和活性++++++细胞免疫+++++四、HSV糖蛋白的抗原结构gC-1有9个抗原决定簇，集中在2个不同的抗原结构域中。结构域I位于分子的C末端部分；结构域II位于N末端，后者是由3个重复的但不同的亚结构域所组成。gD有8个抗原结构域，其中一些是型特异性的，另一些则是型共同的。抗原决定簇一般是由5～7个氨基酸残基所组成，不同的抗原决定簇有不同的结构，连续性抗原决定簇是由直接经多肽链连接的氨基酸残基所组成；而不连续性抗原决定簇的氨基酸残基不是直接连接的，它们在一级结构上分散在各部分，由于蛋白折叠的缘故而连在一起。采用单克隆抗体，可以区分这两类抗原决定簇，在操作上，不连续性的抗原决定簇可在还原和碱处理的变性条件下被破坏，而连续性的抗原决定簇在此条件则可保留。gD的8个抗原决定簇，gD-1有7个，其中3个是连续性的，分别位于成熟糖蛋白分子的268～287、340～356和11～19位，另4个是不连续的，位于成熟分子的N端头260个氨基酸内。五、机体免疫反应用HSV毒粒或受染细胞免疫动物，所有HSV糖蛋白均可引起中和抗体的产生，纯化的gB、gC、gD和E可以分别地产生相应的中和抗体，但gD引起中和抗体的能力最强，所以gD具有制备各亚单位疫苗的前景。特异性单抗包括gB-1、gB-2、gC-1、gD-1、gD-2、gE-1gE-2和gH-1，可以保护动物的HSV致死性感染。但是，也有证据说明，中和作用不是抗病毒感染的主要保护机制。抗HSV的细胞毒性T淋巴细胞可保护小白鼠的致死性腹腔内HSV1感染。HSV1的糖蛋白涉及这一细胞免疫过程。如将成熟HSV糖蛋白用2-去氧-D-葡萄糖，衣霉素破坏后，可以降低它对T细胞介导的溶解的敏感性，这些糖蛋白的功能可能是涉及抗体依赖性细胞介导的细胞毒。第五节疱疹病毒的繁殖病毒囊膜上的糖蛋白可使病毒与敏感细胞接触，病毒囊膜糖蛋白（gpB）可引起与细胞胞浆膜相融合，使核衣壳直接进入胞浆。在胞浆内，核衣壳向核孔移动，病毒DNA随即释放进入核内，开始病毒繁殖，在单层细胞培养上晦暗期为5～6小时，而对数生长期可达17小时，每个细胞可产生104～105颗粒，但仅有100个有感染性。病毒DNA的复制呈连锁调控。当病毒DNA进入核之后，宿主细胞RNA多聚酶II即开始从不同的非邻近区段转录，产生5种早期（α）mRNA，产生α蛋白，则可导致病毒基因组其它区段的转录，产生晚早期（β）mRNA，β蛋白可阻断α蛋白的合成，导致第三组RNA的转录，加工成晚期rmRNA。这样，mRNA的合成和翻译是协调的，α蛋白的形成对β蛋白的合成是必需的，这些非结构蛋白和次要结构蛋白对晚期主要结构蛋白（r）的合成则是必需的。所有r蛋白的合成不依赖于病毒DNA的复制：r1蛋白，如gpB和次要衣壳蛋白VP5在无病毒DNA合成的情况下就可以合成，但浓度较低；而r2蛋白（gpC）则严格需要DNA的复制。这三套mRNAs产生约50个病毒蛋白。病毒DNA的复制需要α和β蛋白，包括DNA多聚酶和DNA结合蛋白及宿主细胞酶类。DNA复制涉及复杂的复制型中间体的形成，包括“头-尾”相连的连结体环和线环-形式。连结体DNA经切割，包装成核衣壳，无感染性且不稳定。当于核膜插入病毒糖蛋白获得囊膜成熟时，成为具有感染力的病毒，从受感染细胞通过内质网缓慢释放。在组织培养上大约只有25%的病毒DNA和蛋白装配成毒粒，在核内可形成嗜碱性包涵体。第六节马立克氏病病毒的分子生物学马立克氏病病毒（MDV），又名鸡疱疹病毒2型，是引起禽马立克氏病（Marksdisease,MD）的病原。该病是一种具有高度传染性、淋巴细胞增生性疾病，病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器、肌肉和皮肤发生单核细胞浸润为特征。本病既是危害世界养禽业最严重的传染病之一，又是世界上第一个用疫苗预防病毒性肿瘤获得成功的范例。根据致病性和血清学反应的不同，可将MDV相关疱疹病毒划分为3个不同血清型：血清1型包括引起高发性内脏或神经肿瘤的MDV及其传代后失去致病性和致瘤性的弱毒变异株；血清2型为非致瘤性自然弱毒株；血清3型为用于疫苗的火鸡疱疹病毒，亦无致病性。一、MDV基因组MDVDNA为线状双股分子、浮密度1.706g/cm3，G+C含量46%，分子量108～120×106D，相当于166～184kb。从感染的宿主细胞提取病毒DNA相当困难。应用DNA克隆片段作交叉杂交或电镜检查，可见变性的MDVDNA是由大小不同的两个单链环通过一双链臂连接而成，两个单链环分别来自长单一序列（UL）和短单一序列（Us），双链臂则由末端长、短反向重复序列（TRL、TRS）与相应的内部长、短反向重复序列（IRL、IRS）碱基互补而成。MDV基因组这种结构与α-疱疹病毒亚科的HSV-1、牛的溃疡性乳头炎病毒（UMV）、β-疱疹病毒亚科的CMV相同，而与γ-疱疹病毒亚科的EB病毒及α-疱疹病毒亚科的伪狂犬病病毒（PRV）不同。构建了MDV血清1型BamHI、BglI和SmaI内切酶图谱、THV（火鸡疱疹病毒）DNA基因组的BamHI、HindII、PstI限制性内切酶图谱和MDV血清2型DNA基因组的BamHI、EcoRI和XhoI的限制性内切酶图谱。比较分析发现，在非严格条件下，三个血清型的DNA之间有一定同源性，但在严格条件下杂交，几乎不显同源性。它们各有一个独立的限制性酶切图谱。MDV基因组编码多种病毒特异性的蛋白抗原，对这些抗原基因的逐个定位及其结构分析，其中主要的有：1．分泌性糖蛋白（gP）57-65（即A抗原）：编码该糖蛋白多肽前体基因定位于UL区4.6kb的BamHI-B片段（精确位点在PvuII-EcoRI双酶切位点之间2.35kb亚片段），基因转录方向从PvuII—EcoRI，该亚片段包括一个由1515bp组成的开放阅读框（ORF），其中G+C为41%，经翻译后可产生505个氨基酸残基组成的、分子量为56805D的多肽。2．非分泌性gP100、gP60、gP49糖蛋白复合物（即B抗原）：该基因定位于UL区中部BamHIK3和I3两个相邻片段，它包括可编码865个氨基酸的原始翻译产物的单个ORF，其中G+C为42%，ORF两端负责启动和终止转录的序列十分保守。据推测MDVgB基因与HSV、PRV、VZV的gB基因有广泛同源性。几种病毒gB氨基酸同源性比较分析，可发现MDV与α-疱疹病毒之间同源性平均为50%，而与CMV和EB病毒同源性分别只有29%和28.2%。3．38Kd磷蛋白（pp38）：该蛋白与MDV致瘤性有关，其基因定位于BamHIH片段，它包括一个由870bp组成的单个ORF，编码290个氨基酸残基组成的多肽。在BamHID片段未见有PP38的整个ORF复本，但在该片段TRL区发现部分相同序列（可编码45个氨基酸）。4．5.5kb大小的EcorRI片段序列：在MDV基因组Us区中部，确定了5.5kb大小的EcorRI片段序列。它包括有6个ORF，其中除ORF1转录方向由右向左外，其余均是由左往右。ORF1与编码HSV-1（Us2）基因同源，并与ORF2广泛重叠；ORF3与HSVUs3基因同源，即编码蛋白激酶（PK）基因所在。ORF4似乎是MDV独特的，但通过与HSV-1gG比较，可见两者有明显相似性，故认为ORF4为HSV-1gG同源基因。编码MDVgD的ORF5与HSVgD基因高度同源，ORF5可编码398个氨基酸残基组成的多肽，靠近ORF5的N′端有一条疏水区，信号肽的切除在此进行。在C′端也有一个疏水区，具有跨膜功能。MDVgD中许多氨基酸残基（60～260位置）在哺乳动物α-疱疹病毒中是保守的，尤其是7个半胱氨有6个在同一处出现，表明它们有类似的三级结构。MDVgD与HSV、PRV和VZVgD总的相似性分别为43.8%、42.9%和41%。编MDVgI的ORF6仅作了部分测定，已明确编码其中252个氨基酸的序列，根据PRV和HSVgI长度推算，估计已测定部分可代表MDVgI靠近N′端的65～70%。与其它疱疹病毒gI序列比较，MDVgI最保守区域位于分子的中部至N′端。5．感染细胞多肽4（ICP4）：该基因定位于US区的BamHI-A片段，编码区全长4245bp，G+C为52%，预计MDVIVP4蛋白有其它疱疹病毒ICP4的相似结构，该基因已在鸡胚成纤维细胞（CEF）中得到成功表达。6．P79蛋白抗原：为共同抗原，该基因定位于BamHIR片段及R片段两侧的O和B片段。7．meq基因：该基因与MDV致瘤密切有关，定位于IRL区的BamHII2片段及与此片段重叠的EcoQ片段。它包括一个编码362个氨基酸的ORF，其对病毒的潜伏状态有控制作用。它仅存在于MDV致瘤株，在肿瘤细胞中能持续高水平表达，尤其是它编码的蛋白质具有类似鸡的fos/jun等核内肿瘤基因产物的亮氨酸“拉链结构”，表明它很可能是一个肿瘤候选基因。二、病毒特异性蛋白和抗原最初，采用琼脂凝胶沉淀反应（AGP）从MDV感染细胞检测到3种主要抗原，分别称为A、B、C抗原，当型特异性McAb的发展和体外转译、分子杂交等方法的应用，促进了病毒特异性蛋白和抗原的研究，现已鉴定出至少46条MDV特异性蛋白带，其中较为清楚的有：1．A抗原：是由MDV和THV感染细胞产生和分泌的一种主要抗原，存在于感染细胞培养物上清，也见于细胞表面和胞浆中。A抗原可与常规免疫血清构成AGP的主要沉淀线；在细胞培养物上连续传代时，伴随病毒致弱的同时出现A抗原产量降低。该抗原为57～65Kd的糖蛋白，与致瘤性无关，也无病毒中和作用，有人推测它在羽毛囊上皮细胞的病毒粒子免疫逃遁方面有一定作用，尤其与细胞早期感染及病毒侵袭淋巴细胞有关。由于缺乏直接证据，A抗原究竟有何功能仍是一个有待探讨的课题。2．B抗原：由3种分子量不同gP(100Kd,60Kd,49Kd)组成的复合物，是一种非分泌性抗原，仅存在于细胞表面和胞浆。与CMV、PRV、VZV等gB翻译后加工过程一样，MDVgB最初来自非糖基化92Kd(pr88)多肽前体，糖基化后成为gP100中间体，然后，gP100中间体的二硫链断开，形成gP60和gP49。B抗原是MDV非常重要的一种中和性抗原，用部分纯化的B抗原免疫鸡后，有诱导产生中和抗体，抵抗强毒攻击，因而在基因工程疫苗设计中应首先考虑。3．磷蛋白抗原：用SDS或致瘤性血清1型MDVMcAb作免疫沉淀反应，可从MDV感染细胞裂解物中检出分子量为41Kd、38Kd、24Kd的一组蛋白带。其中38Kd的为一种磷蛋白（pp38），它是MDV诱导的非生产性肿瘤细胞系中唯一可检出的一种病毒特异性抗原，因此该抗原可能与病毒致瘤性密切相关。4．蛋白激酶（PK）：疱疹病毒编码至少两种不同的PK，一种定位于α-疱疹病毒Us区，另一种在HSV-1、VZV的UL区。MDVUs区ORF3与前一种PK关系更为密切。与HSV、VZV、PRV相应PK比较，MDVPK氨基酸总相似程度高达51%、53%和50%，而在催化区这种相似性更明显（分别是60%、64%和63%）。目前对PK在MDV生长周期或致瘤性方面的作用还不明了，但有证据表明MDVPK与MDV蛋白磷酸化有关，从而直接或间接地调控酶功效和促进细胞分裂。5．gD和gI（糖蛋白D和I）：由MDVUs区ORF5和ORF6分别编码的这两种糖蛋白还了解不多，但是据来自HSVgD研究认为gD是HSV感染中不可缺少的，在病毒感染的初始阶段发挥重要作用。在痘苗病毒重组体表达时，它是抗HSV的一种重要免疫原。MDV在鸡羽毛囊上皮细胞中可能表达gD，它的确切功能有待进一步研究。gI对MDV体外培养并非必不可少，但还如PRVgI一样，有可能起毒力作用。至于Us区ORF1编码的US2及MDV属共同抗原79Kd蛋白的功能尚不清楚。6．ICP4多肽：根据氨基酸顺序推测，可将MDVICR4划为5个区，其中2区和4区最保守（HSV和VZVICP4也是如此）。在N′端可见由丝氨酸残基构成的特征性区段。对HSVICP4作进一步研究，它是一种具有调节功能的病毒早期介导蛋白。在病毒溶细胞感染或潜伏感染及控制感染状态的调节方面，早期介导蛋白起着关键作用。虽然MDVICP4具有相似结构域，但是否仍保留有相似的功能，还需作进一步研究加以证实。7．meq蛋白：meq蛋白结构很特别，它以亮氨酸“拉链”重复和碱性氨基酸富集的上游结构域，构成转录激活剂fos/jun家族的成员之一。此外，在C′端有一个脯氨酸富集区，具有另一类转录因子的特征。预测meq（MDVEcoQ）蛋白分子量为39.7Kd，这已在MDV转化的类淋巴细胞系中检出一分子量为40Kd蛋白所证实。8．其它抗原：利用不同的McAb作免疫沉淀反应，检出了两个与生产性感染细胞核有关的抗原，分子量分别为145～155Kd和135Kd，后者具有与DNA结合的特性。在生产性感染细胞浆，还发现一种分子量为92Kd的病毒特异蛋白，可被许多McAb予以识别。在潜伏感染的肿瘤细胞抽取物中，可见一种与MDVDNA克隆片段结合的2.8Kd蛋白，但在生产性感染细胞中则无。此外，在THV粒子的囊膜中可能结合有宿主细胞抗原。9．病毒诱导的酶：一种分子量为100Kd的DNA聚合酶，用磷酸纤维素柱层析可以部分纯化，另外用THV和MDV血清1型可在CEF中诱导产生一种87Kd的胸腺嘧啶的酶，其活性可抗血清部分中和。三、MDV致瘤株的鉴定很久以来，人们就注意到MDV致瘤株与非致瘤株DNA结构差异的比较。MDV强毒株在细胞培养物上连续传代时，在致瘤性失去的同时伴有MDVUL两侧TRL和IRL中BamHI的D和H片段上132bp串联正向重复的扩增，可能由于扩增致使1个或多个致瘤基因无法表达。132bp串联正向重复区核苷酸序列高度保守，许多研究表明132bp重复区通过控制转录方式在血清1型MDV致瘤中发挥作用。应用血清学方法无法对均属于血清1型的致瘤株和非致瘤株作出鉴定。Silva等采用放射性标记探针（EcoRIF片段）作Southern印迹杂交，检查不同代次MD11，发现MD11在传到60代时，EcoRIF片段消失，但在F片段前出现一较宽的拖迹片段，能与EcoRIF片段杂交。PCR技术，在用于MDV不同血清型，尤其是致瘤株与非致瘤株的鉴定方面，具有广阔应用前景。四、MDV核酸探针诊断Davidson等以鸡羽毛囊为抗原，比较了ELISA、AGP、Dot-印迹杂交法，认为ELISA比AGP敏感，ELISAOD值≥0.3的样品，大多可与MDVDNA探针杂交。Dot-印迹杂交法敏感性和特异性都高，具与ELISA和AGP有良好相关性。Malkinson等比较了不同方法检出鸡羽毛囊病毒的时间、接毒感染鸡检出的时间为：ELISA，10～14天；AGP，14～24天；Dot-印迹杂交，11～18天。接触方式感染鸡的检出，AGP比其它两法晚14天。由此可见ELISA和Dot-印迹杂交法适合于自然病例的早期诊断。Levy等还用核酸探针从THV免疫鸡的羽毛囊中检出MDVDNA，证实THV免疫不能完全防止MDV在鸡羽毛囊中的复制。对MDV核酸探针的应用，国内许多研究者作了大量工作。单松华等用缺口平移法制备的生物素标记探针，可用于鉴定MDV感染细胞培养物，诊断毛鸡或光鸡MD。3种方法比较，认为Dot-印迹杂交法高度敏感，可达pg水平，而Dot-ELISA和AGP的敏感性稍差。钱建飞等和李光富等分别用光敏生物素和地高辛标记MDVDNABamHIL片段，一致认为Dot-印迹杂交法较AGP敏感，且可用于强毒株与THV疫苗株鉴别。崔治中用地高辛标记探针，能从强毒感染18天的鸡羽毛囊中检出病毒DNA。五、基因工程疫苗研究近况近几年来，有关MDV基因表达的研究十分热烈，并取得了许多成果。1．A抗原：杨宝华等将MDV基因文库BamHIB片段酶切获得2.2kb亚片段，PCR法克隆于其中A抗原基因（1.8kb），与载体pKK223-3构建了重组质粒，在E.coli系统获得了成功表达。Nilkura等将MDVA抗原基因与杆状病毒重组