第4章 细胞培养的基本技术

第4章细胞培养的基本

技术教学目的1、掌握细胞培养操作基本要领和要求2、了解细胞培养常用的基本方法和操作要领无菌技术贯穿细胞培养的始终一、基本操作技术和要求一、培养室内的无菌操作第一节细胞培养操作基本要领和要求(一)培养前的准备有条不紊和安全可靠1.培养用物品的灭菌消毒(写出物品的清单)2.操作台的消毒(各种物品布局合理进行紫外线消毒30分钟;3.洗手和着装(原则上与外科手术相同)4.火焰消毒(酒精灯使用、金属器械、吸过培养液的吸管).（一）无菌操作培养前准备：准备好所需物品清点无误放置操作场所。培养室和超净台消毒：0.2％新洁尔灭拖地紫外线照射30-50min/d75%alcohol擦洗台面紫外线消毒勿照射培养细胞和培养液每天操作前洗手和着装：严格按照外科手术要求消毒着装，操作前75％alcohol消毒无菌培养操作：整个实验过程保持无菌操作。点燃酒精灯，一切操作在火焰附近烧灼进行。烧灼时间勿过长防止退火。洗过培养液的吸管不能再烧灼。橡胶物品不能烧灼时间过长。吸管不能混用。（二）培养细胞的取材1.基本要求：

“快”，少于24h

“无菌”

用锋利的器械切取组织减少损伤血液，脂肪，神经组织等要弃去培养液营养要丰富，胎牛血清10-20％成功率：胚胎组织>成熟个体肿瘤组织>正常组织2.基本器材和用品眼科组织剪刀弯镊手术刀（消毒）装有无血清培养基或Hank’s液的小瓶小烧杯培养皿3.取材皮肤粘膜取材：上皮细胞培养来源内脏和实体瘤：体内所发生肿瘤及各脏器是常用材料血细胞：静脉，耳垂或手指取血，肝素抗凝骨髓，羊水，胸水，腹水：离心后立即培养。鼠胚组织：引颈法处死整个浸入75％alcohol5min

固定于木板取材鸡胚组织：将蛋以气室向上置烧杯中消毒剪刀环行剪开蛋壳玻璃棒挑出鸡胚

（三）组织材料分离细胞悬液：500-1000rpm低转速离心5-10min

组织块：机械分散法:剪刀剪取后反复吹打剪切分离法：剪或切成1mm3培养

消化分离法：

⑴胰蛋白酶法

使用最广泛。适宜消化间质少的软组织如肝肾等，对硬癌组织效果差。所需时间较短，主要缺点是破损细胞。⑵胶原酶解离细胞法：对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。价格较高，大量使用增加成本。⑶EDTA法：较胰蛋白酶作用缓和，适宜消化分离传代细胞。二、原代培养

取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长细胞在传代之前称为原代培养。

1.组织块培养法：常用，简单，成功率高。1000ml100ml2.消化培养法：快速得到大量活细胞，适宜培养大量组织，原代细胞产量高。步骤繁琐，易污染，一些消化酶成本高，价格昂贵。3.器官培养：从供体获得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在体外进行培养。要求：特殊培养条件r<1mm

足够氧气渗入三、传代培养和细胞系的维持1.原代细胞的首次传代传代：细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程。是建立细胞系关键的时期。细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁大部分表面以前不要传代。根据细胞不同消化时间具体处理。首次传代细胞数量要多。2.细胞传代方法贴壁生长：采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。悬浮生长离心法传代直接传代法半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.细胞系的维持“换液”传代”“再换液”“再传代”“细胞冻存”4.培养细胞的纯化⑴自然纯化：利用某种细胞增殖优势排挤其它细胞。无法人为选择，时间长，适于恶性肿瘤。⑵人工纯化：酶消化法：利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同。机械划除法：用橡皮刮子或弯头滴管直接从瓶壁刮除。反复贴壁法：利用上皮细胞和成纤维细胞贴壁时间和稳定性不同。培养基限定法：某些细胞在生长过程中必须存在或去处某种物质。流式细胞仪分离法：利用细胞核酸含量，某些物质含量或细胞结构大小等参数分离。5.原代培养细胞的生命归宿原代培养期传代期衰退期五、细胞冻存、复苏和运输细胞的冻存、复苏和运输教学目的1．掌握培养物的冷冻保存与复苏原理2．掌握冷冻保存的常用方法3．掌握冻存细胞的常用复苏方法4．掌握细胞运送的几种方法□1776年Spallanzani最早发表了“冷”处理对马精子生命活动的影响的报道，用雪冷冻玻璃瓶中的马精子10多分钟之后，再将玻璃瓶放回室温下，精子又“复活”.□1900年前后，基本肯定生物成分能够在零下温度贮存的事实。□1949年至1960年称“甘油时期”。□1959年：二甲亚砜（DMSO）发展史一、培养物的的冷冻保存与复苏1．概念１）冷冻保存(cryopreservation)：是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。2）复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程3）因细胞内部结冰而致的细胞损伤被称为细胞内冰晶的损伤(intracellularicedamage)。4）保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤或称溶液损伤(solutiondamage)原则：慢冻快融细胞的低温冷冻储存：

是细胞培养室的常规工作和通用技术。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。⑴原理：在低于－70℃的超低温条件下，细胞内部的生化反应极其缓慢，甚至终止。

⑵原则：缓慢冷冻

当细胞冷到零度以下：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．冰晶就大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。细胞冻存所用用品⑶慢冻程序标准程序：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min

当温度达-25℃以下时，5～10℃/min

当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。液氮罐⑷低温保护剂的应用渗透性：具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、甲醇等。常用的是DMSO，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

非渗透性：非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。

⑸冷冻保存温度冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度。（1）应控制冻存细胞的质量。（2）不宜将冻存的细胞放置在0～－60℃过长时间。低温损伤主要发生在这一温度范围内；（3）冻存小管宜采用塑料冻存管，不宜用玻璃安瓿。注意事项⒉细胞复苏方法原则：快速复苏（l）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养复苏的细胞3.培养细胞的运输冷冻储存运输：利用特殊容器盛液氮或干冰保存。效果好但麻烦。充液法：选生长状态好的细胞，生长1/3－1/2瓶底壁，弃掉旧培养液，补充新培养液至瓶颈留微量空气，封口膜封口。贴身携带，达目的地后倒掉多余培养液，次日换液。四、细胞系及其鉴定

原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系(Cellline)。各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。1.细胞系鉴定当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。细胞系的细胞来源鉴定细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞细胞系的稳定性，即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等2.细胞系鉴定指标⑴染色体：染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。采用染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测。⑵同工酶谱：通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。

⑶细胞DNA遗传特征:

3.细胞株建立要求及管理⑴记录要求：

组织来源、细胞生物学检测、培养条件和方法⑵鉴定、管理和使用

按国际惯例，在杂志或刊物上报道，详细介绍上述各项目即可。各国管理中心、细胞库美国标准细胞库ATCC(AmericanTypeCultureCollection)、人遗传突变细胞库HGMR、细胞衰老细胞库CAR

ATCC入库细胞要求检测项目（基本要求）：

培养简历：组织来源日期、物种、供