第2章 基因工程制药(二)

第二章第十三节基因工程药物的制造实例一、干扰素干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素再分为α1b、α2a、α2b等亚型，其区别表现为个别氨基酸的差异。早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要。现在可以利用基因工程技术在大肠杆菌中表达、发酵来生产干扰素。1.基因工程菌的组建组建过程：分离干扰素mRNA，以mRNA为模板反转录合成cDNA，将cDNA克隆到载体中并转化大肠杆菌K12，获得干扰素基因工程菌。所克隆的干扰素cDNA是从抗病毒活性最高的12SmRNA区域合成的。克隆载体pBR322质粒，含有四环素和氨苄青霉素抗性基因。pBR322质粒结构图重组人干扰素产品组建干扰素工程菌的流程诱生的白细胞提取全RNA

通过寡dT-纤维素柱获得mRNA5%～23%蔗糖密度梯度离心提取12S的mRNA

自mRNA反转录成cDNA双链cDNA用末端DNA转移酶接上dT或dG尾pBR322质粒pBR322质粒DNA的PstⅠ酶切割加上dA或dC

退火获得杂交质粒转化大肠杆菌K12扩增杂交质粒筛选抗四环素但对氨苄青霉素敏感的细菌克隆

用已知干扰素的DNA片段作为探针挑选富有干扰素cDNA的克隆

将干扰素cDNA克隆入表达载体在大肠杆菌中进行高效表达

2.基因工程干扰素的制备制备基因工程α-干扰素工艺流程如下：启开种子制备种子液发酵培养粗提半成品检定半成品制备精提

分装冻干成品检定成品包装α2b干扰素生产过程1.发酵工程菌：SW-IFNα-2b/E.coliDH5α，质粒用PL启动子，含氨苄青霉素抗性基因。培养基含1%蛋白冻、0.5%酵母提取物、0.5%NaCl。接种后摇床培养30℃，10h，发酵种子。15L发酵罐培养，30℃，转速500r/min，8h。然后42℃下诱导，2～3h。离心去上清。2.产品的提取与纯化

4000r/min离心30min，去上清后，湿菌超声破碎，离心，取沉淀部分用溶解缓冲液进行处理，上清超滤浓缩，SephadexG-50分离。经SDS检查。再经DE-52柱纯化。3.质量控制标准和要求3.1半成品检定⑴干扰素效价测定⑵蛋白质含量测定⑶比活性⑷纯度测定⑸相对分子量测定⑹残余外源性DNA含量测定⑺残余血清igG含量测定⑻残余抗生素活性测定⑼紫外光谱扫描⑽肽图测定⑾等电点测定⑿除菌半成品干扰素效价测定、无菌试验、热原试验。3.2成品检定⑴物理性状⑵鉴别试验⑶水分测定⑷无菌试验⑸热原试验⑹干扰素效价测定⑺安全试验二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor，GMCSF）是一个具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其它的细胞，如抗原递呈细胞、成纤维细胞、角质细胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。GMCSF对某些疾病，如肿瘤患者放疗、化疗以后的白细胞减少症、再生障碍性贫血和骨髓移植的治疗有重要作用，以及在抗病素、抗真菌感染等的治疗中也有良好的疗效。1985年Sieff等发表了第一篇有关重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的文章后，这些年来有关rhGMCSF研究报道的文献每年均在千篇左右。GMCSF是糖蛋白，相对分子质量为22000，基因定位在第5条染色体长臂上，基因约2.5kb，含有4个外显子和3个内含子。其mRNA包括编码成熟蛋白质的127个氨基酸残基和信号肽的17个氨基酸残基的密码子。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子产品1.人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的制备利用表达分泌型GMCSF工程菌W3100/pGMCSF可以表达具有天然结构和生物活性的GMCSF，表达量高，易于纯化，无需复性，纯化的GMCSF比活高于包含体型，但其发酵表达技术较难掌握。分泌型GMCSF工菌型W3100/pGMCSF发酵工艺发酵甘油保存菌划平皿，挑取单菌落，接种于LB种子培养基中，18h，再扩大培养12h，接种于30L发酵罐，30℃培养，过程中流加50%的葡萄糖、酵母浸出液及酷素水解物。培养20h左右时开始表达，28h表达是高峰，之后细菌开始死亡，杂蛋白增加。培养过程中，尤其是对数期，用葡萄糖的加量来控制细菌生长速度，以免溶氧量下降过快。发酵产物为分泌型GMCSF，占菌体总蛋白的25%以上。发酵产物收集、纯化离心离子交换层析或亲和层析纯化超滤浓缩，分子筛除菌过滤、分装、冻干近年应用较多的还有融合蛋白表达GMCSF的方法。采用ＰＣＲ方法改建人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子的ｃＤＮＡ，３′换用ＴＡＡ终止密码，将其克隆入多种不同表达融合蛋白的载体中，并在ｃＤＮＡ与上游细菌蛋白基因之间嵌入凝血酶接头，导入适当宿主后均获得高效表达，表达融合蛋白经凝血酶消化后释放出Ｎ－末端与天然成熟蛋白一级结构（糖基化除外）完全相同的ｒｈＧＭＣＳＦ，经层析纯化可得到适宜人体应用的活性蛋白。2.质量控制标准和要求半成品检定

主要包括下列项目：蛋白质含量测定，活性测定，比活性测定，相对分子质量测定，纯度测定，核酸含量测定，鼠IgG含量测定，等电点测定，无菌试验，热原质等。成品检定

主要包括下列项目：外观检查，活性测定，水分测定，无菌试验，安全毒性试验，热原质试验，肽图测定等。三、人白细胞介素-2人白细胞介素-2（interleukin-2,IL-2）是由T淋巴细胞分泌的一种糖蛋白，为一种多肽类药物，又称T细胞生长因子。其在机体免疫应答中具有重要作用，是一种免疫增强剂，具有抗病毒、抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。天然白介素-2由396个核苷酸加上起始密码和终止密码组成，编码133个氨基酸，其中含有三个半胱氨酸（58、105和125位），第125位Cys的巯基游离，易引起IL-2分子内二硫键错配或分子间二聚体的形成，从而降低IL-2的生物活性与稳定性，同时增加其不良反应。重组的未加改构的人白介素-2多以包含体形式表达，在变性与复性过程中易形成二硫键错配，为进一步提纯带来困难。为解决上述问题，可将重组IL-2经过密码子突变，将第125位的半胱氨酸改为丙氨酸。1.重组人白细胞介素-2重组人白细胞介素-2是通过反转录PCR技术从外周血单个核细胞中克隆到人的白细胞介素-2cDNA，再通过基因定点突变技术，针其第125位半胱氨酸的密码子突变为丙氨酸或丝氨酸的密码子，从而防止分子内二硫键的错配或分子间二聚体的形成，增强药物的稳定性与生物活性，减少不良反应。在临床应用上与普通IL-2比较，改构体的活性增高，疗效增强，半衰期延长，热稳定性好，纯度高，不良反应显著减少。重组时利用定点突变方法将天然IL-2的第125位氨基酸由Cys改为Ala（密码子由TGT变为GCT），获得新型IL-2——

设计并人工合成两条寡核苷酸引物：引物1：5’-AGC

AAT

TCCATGGCACCTACTTCAAGT-3’引物2：5’-ATGGATCC

TTATCAAGTCAGAGTCGAGATGATGCTTTGAGCAAAGGT-3’1.重组人白细胞介素-2工程菌的生产PCR扩增得到0.4kb大小的DNA片段，经鉴定为含Ala125突变的IL-2基因。PCR片段用EcoRⅠ-BamHⅠ双酶切。将表达质粒pBV220同样用EcoRⅠ-BamHⅠ酶切，并用T4DNA连接酶使之与PCR扩增的重组IL-2编码基因连接，得到重组质料pBV220/IL-2。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，得到Ala125IL-2的工程菌株。表达的Ala125IL-2可占菌体总蛋白的42.7%。超声波裂菌离心收集包含体SephacrylS200凝胶过滤氧化剂复性透析除盐获得纯品产品纯HPLC分析鉴定，纯度可达99%以上，用3H-TdR掺入法进行活性测定，比活性1×107U/mg，比野生型IL-2比活性平均提高30%。rhIL-2产品四、重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)早在1940年，Hoftman等在脑和垂体的抽提物中发现一种能够促进成纤维细胞生长的物质。1974年该物被分离纯化，并命名为成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactor，FGF）。接着，人们又分离出一种与之高度同源的物质，由于它含有较多的酸性氨基酸碱基，等电点为酸性（5.6），故命名为酸性FGF（aFGF）。先发现的FGF因对酸和热敏感，等电点呈碱性（9.6），则称为碱性FGF（bFGF）。现今资料表明，bFGF的生物学作用极其广泛，它在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生和神经组织生长发育过程中起着十分重要的作用。bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，其氨基酸序的55％和aFGF相同，分子量为16～18.5KD。bFGF分子结构中有4个半胱氨基酸，以此形成分子的三维空间结构。由丝氨酸取代半胱氨酸的重组bFGF的生物学活性不变，而单链多肽则易于在大肠杆菌中表达。bFGF基因位于人的第5对染色体上，为单拷贝基因，呈不连续状态，其功能区被两个内含子隔开分为三个外显子区域。bFGF有很强的肝素亲和力。bFGF基因中未发现信号肽顺序，可经自分泌方式释放。国内第二代基因重组h-bFGF也已经问世，并正式批准生产。rh-bFGF工程菌的载体多用PUC系列质粒，含有氨苄抗性、LAC启动子，以大菌杆菌作为宿主。生产时使用IPTG诱导表达，rh-bFGF可分泌至胞浆中，采用连续流加葡萄糖的高密度分批发酵工艺，经11h后可获得产量达200mg/L的bFGF，经亲和层析（多用肝素亲和）纯化后可获得高纯度的bFGF，其理化及生物学特点符合药用要求。五、重组人超氧化物歧化酶（rh-SOD）SOD是一种生物高效抗氧剂，能特异性消除氧自由基。而rh-SOD不仅仅在类风湿关节炎、心血管等疾病上有独到之处，还广泛应用于保健品、化妆品领域，天然SOD制品是从牦牛血液中提取的，主要以红细胞为起始材料，投资大、能耗高、收率低、成本高，价钱十分昂贵。基因工程的方法：从胎肝中获取微量rh-SOD后，RT-PCR得到SODcDNA，在大肠杆菌中克隆表达，并通过rh-SOD工程菌的发酵、纯化的研制，在模拟生产条件下进行中试工艺放大，纯化后得到rh-SOD产品。将含有人体SOD基因的PCR252载体的大肠杆菌接种子培养基中，在32℃的温度下，发酵培养24小时，再加入占发酵液重量1％的硫酸铜清液，再向发酵液加入3倍体积的去离子水，用震动式破碎机剧烈震动破碎30min，静置20min，置入每分钟