开题医学研究生幻灯片

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莅临指导肺泡表面活性物质研究生:钟红平

导师:教授主要内容1.选题的目的2.选题的理论和实际意义7.目前进展情况3.主要研究内容5.主要研究方法4.主要技术路线6.预期结果选题目的本课题以RDS大白鼠模型和健康大白鼠通过检测KLF2转录因子和KLF2mRNA在大白鼠肺组织表达以及RDS大鼠甲状腺素水平的变化的研究，确立甲状腺素和KLF2对肺泡Ⅰ型细胞功能调控以及在RDS发病中所起的作用和机制，提出了在对肺表面活性物质治疗不敏感的NRDS中一种新型的治疗选择,为早期给NRDS患儿甲状腺素替代治疗提供理论依据。选题的理论和意义

新生儿呼吸窘迫综合症（NeonatalrespiratorydistresssyndromeNRDS)是新生儿早期死亡的重要原因，临床特点为出生后不久即出现进行性呼吸困难、青紫、呼气性呻吟、吸气性三凹征和呼吸衰竭。本病由于早产儿肺结构不成熟、缺乏肺表面活性物质(PS)引起。病理特征为肺泡壁至终末细支气管壁上广泛嗜伊红透明膜形成并肺不张，若不治疗,可发生进行性低氧血症和呼吸衰竭,甚至死亡【1】。NRDS不仅容易发生在早产儿，而且选择性剖宫产足月新生儿也容易发生，目前对NRDS的治疗主要是采用补充外源性的PS联合机械通气治疗，外源性的PS价格非常昂贵。但值得注意的是约20％至30％NRDS的患儿对表面活性剂替代疗法不敏感【2】，尤其是胎龄越小的早产儿由于肺泡结构发育不成熟，对外源性表面活性剂无反应，建立成功的治疗方案往往因对NRDS的发生、发展的认识而受到很大的限制。因此进一步了解NRDS的发病机制和对外源性表面活性剂无反应机理是十分重要的。目前对于NRDS的发病机制主要集中在肺泡Ⅱ细胞功能上，近年来对NRDS的认识逐步发展到对肺泡整体细胞功能的调控上，尤其是肺泡Ⅰ型细胞的功能调控越来越受到重视。如何调控肺泡Ⅰ型细胞的功能是目前的研究热点。肺泡I型上皮细胞的功能在NRDS的发病机制中起重要的作用。国内外经过长期的研究证明【3-5】I型肺泡细胞负责进行气体交换，Ⅱ型肺泡细胞产生PS，降低肺表面张力。糖皮质激素和他们的同源受体已经很早被知道可以促进Ⅱ型肺泡的成熟，来协调PS的产生。产前孕母糖皮质激素的预防应用和新生儿外源性的PS替代治疗作用还是不能降低NRDS的发生和改善部分NRDS的症状，所以目前提出只有I型和II型肺泡细胞功能协调，相互调节平衡才能保证肺泡的扩张和有效的气体交换。但是对于I型肺泡通路控制的细胞介导的气体交换却知之甚少。

LimingPei等【2】在小鼠的研究中发现SMRT的突变从而导致1型肺泡的早熟，出现一种新型的RDS，尽管对糖皮质激素反应不敏感，但是联合应用抗甲状腺激素类药物完全可以减少SMRT引起的NRDS，表明甲状腺激素受体（hormonereceptorTR）在肺发育中的重要作用还没有被认识到。甲状腺激素与甲状腺激素受体作用形成TR-SMRI复合物，激活下游Krüppel样锌指转录因子(Krüppel-liketranscriptionfac-tors,KLFs)中的

KLF2因子，促进肺泡Ⅰ型细胞的分化和成熟，没有KLF2的小鼠会缺乏成熟1型肺泡，最终导致小鼠在生后很短时间内死亡。死亡的RDS的幼崽和它们同窝出生仔畜相比，肺内KLF2mRNA和蛋白水平较低，组织学检查发现RDS幼崽出现肺不张，并且有很少典型I型肺泡的扁平细胞，但是有丰富的立方形Ⅱ型样细胞，免疫组织化学显示在他们的肺中I型标记物蛋白显著减少，从SP-B，SP-C和PECAM-1染色判定Ⅱ型肺细胞和血管内皮细胞并没有受到影响，这些结果表明，KLF2在I型肺泡的分化和体内正常的肺发育中是必不可少的。进一步研究KLFs是Spl/Krüppel样转录因子(Spl-likeandKrüppel-liketranscriptionfactors,Spl/KLFs)家族中的一个亚家族【6】。在哺乳动物中,KLFs可调控细胞增殖、迁移、凋亡和分化等,它们对早期胚胎发育也至关重要。Krüppel样转录因子2(Kruppel-likefactor2KLF2),是当前研究的热点，由于最初被发现主要在肺内高表达，因此也被称为肺Krüppel样转录因子(LKLF)【7】对肺的发育起关键性作用。甲状腺激素受体和KLF2是I型肺泡细胞分化、成熟的重要受体和因子，国内外对此的研究刚刚开始，还未涉及它们与NRDS的相互关系，甲状腺激素水平和NRDS的相关性研究很少。主要研究内容（2）通过对移植模型中治疗组与模型对照组肿瘤体积变化、肿瘤重量变化及正常组与模型对照组、各治疗组之间胸腺指数与脾指数的变化，研究参雄抗癌丸的作用机制。

（3）本实验采用肿瘤组织HE常规染色，从形态学上观察各组间肿瘤细胞密度，肿瘤坏死程度（1）动物移植性肿瘤模型的成功制备（4）用流式细胞仪检测各组的肿瘤细胞凋亡率；用免疫组化技术观察该药物对肿瘤组织VEGF及MVD表达的实验影响（5）

本项研究采用腹腔种植H22瘤株制造肝癌模型，通过动物实验研究参雄抗癌丸对荷瘤鼠VEGF及MVD表达的实验影响，从分子水平探讨参雄抗癌丸对肿瘤的影响机制。从而为该药提供技术支持，并为其产品开发和走向市场提供理论依据。主要技术路线选购SPF级小鼠动物造模及分组参雄抗癌丸高剂量组参雄抗癌丸中剂量组参雄抗癌丸低剂量组5-FU组模型对照组正常组给药、标本采集和处理检测：1肉眼观察2抑瘤率的测定3HE常规染色4细胞凋亡率及细胞周期的测定5免疫组化检测VEGF和MVD

统计数据，得出实验结果，撰写论文主要研究方法1.实验材料1)瘤株H22北京药物研究所引进，甘肃医学科学院传代保种。2）实验药品参雄抗癌丸由甘肃省医学科学研究院制成水蜜丸剂，每包2克；5-FU注射液3）实验动物

SPF级昆明小鼠，雌雄各半，体重18～20g,5～6w龄，由甘肃省中医学院动物实验中心提供2.实验方法：（1）造模：从H22瘤株传代小鼠的腹腔抽取乳白色的瘤液，用生理盐水稀释至瘤细胞计数为2×106个/ml，胎盘蓝染色证实活细胞数达到96%，将瘤细胞悬液注射到小鼠右前肢腋窝部皮下0.2ml／只，接种的瘤细胞数约为5×106个／只。均在无菌条件下进行（2）动物分组及给药方法:接种次日，将除正常组外的80只小鼠随机分为5组:A组为模型对照组，每日用蒸馏水灌胃；B组为阳性对照组，每天5-FU10㎎/kg腹腔注射；C组为药物高剂量组1560㎎/kg灌胃。D组为药物中剂量组780㎎/kg灌胃。E组为药物低剂量组390㎎/kg灌胃。每天一次，连续灌胃10天。(4)标本采集及处理：实验结束后第二天，将禁食12小时的所有实验动物脱颈处死取脾脏、胸腺和瘤组织。3.观察指标（2）计算相关免疫器官指数及抑瘤率分别按以下公式计算脾指数、胸腺指数和抑瘤率（单位：mg/l0g）胸腺指数=胸腺重量（mg）/体重(g)脾指数=脾脏重量（mg）/体重(g)（3）抑瘤率完整剥离肿瘤,用1/1000电子天平称取瘤重。抑瘤率(%)=(1-T/C)×100%,(T/C:治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)。（4）病理形态学观察瘤组织块以4﹪甲醛固定，石蜡包埋，切片，经HE染色，光学显微镜下观察瘤组织病理变化（1）造模后，观察各组小鼠局部瘤组织情况，小鼠活动、进食、精神状态等情况。（（5）细胞凋亡率的测定

根据试剂盒上的说明书具体步骤进行（6）标本切取:停药次日小鼠颈椎脱臼处死，完整剥离肿瘤，10﹪中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋，石蜡切片厚5um。各组计量资料输入计算机，采用SPSS16.0forwindows统计软件包，以平均值士标准差(X士S)表示，各组间的比较采用单因素方差分析。统计学处理

参雄抗癌丸对荷瘤小鼠的肿瘤生长有抑制作用，治疗后抑瘤率较模型组有显著差异

参雄抗癌丸可提高肿瘤细胞的凋亡率，具有促进或诱导肿瘤细胞发生凋亡的作用。参雄抗癌丸可抑制肝癌组织VEGF的表达水平，同时降低肝癌组织MVD。（各治疗组的MVD和VEGF水平与病理模型组比较均有明显的下降。）

预期结果目前进展情况目前已完成文献检索经费预算1.材料购置费2000元2.试剂购置费3000元3.检测劳务费2500元4.文献检索费200元5.论文打印及版面发表1500元6.论文答辩1500元

共计：10700元实验经费为研究生科研经费研究进度及具体时间安排2007年12月---2008年2月撰写开题报告2008年3月---2008年5月