基因工程-第二章基因工程工具酶

第二章基因工程工具酶工具酶

-----DNA分子的切割和连接技术。

Smith发现了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease，RE)对DNA分子有特异地切割作用。（手术刀剪）

Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），能将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）

DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机）

构成了一个研究DNA、RNA分子的工具酶箱。第一节限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。一、宿主的限制和修饰现象----发现

1952～1953年在T偶数噬菌体和λ噬菌体对大肠杆菌的感染实验中研究者发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究，导致限制性内切核酸酶的发现。

寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的，一种叫修饰的甲基转移酶，另一种叫核酸内切限制酶。寄主控制的限制与修饰的作用，一是保护自身的DNA不受限制；二是破坏外源DNA使之迅速降解。

根据限制-修饰现象发现的核酸内切限制酶，现在已成为重组DNA技术学的重要工具酶。纯化后的限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复的方式切割基因克隆所需的DNA分子。这些酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破性进展。二、限制性核酸内切酶的类型

根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ三大类。

I类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。

Ⅱ类：基因工程的工具酶。

Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点24bp～26bp，对分子克隆操作亦无实用意义。已有超过1200种。性质

I型限制性核酸内切酶蛋白质结构和功能由3个亚基组成的复合功能酶；α内切酶活性，β甲基化酶活性，γ特异性识别序列识别部位不对称序列AACN6GTGC切割部位非特异性，距识别部位大于1000bp限制作用所需的辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性质

Ⅲ型限制性核酸内切酶蛋白质结构和功能由2个亚基组成的双功能酶；M亚基位点识别与修饰，R亚基内切活性识别部位5-7bp的不对称序列切割部位非特异性，距识别部位一侧24-26bp限制作用所需的辅助因子ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸性质Ⅱ型限制性核酸内切酶蛋白质结构和功能独立的内切酶和甲基化酶识别部位短小的回文序列（多数4-6bp）切割部位同于或接近于识别部位限制作用所需的辅助因子Mg2+三、限制性核酸内切酶的命名

H.D.Smith等于1973年提议的命名系统。名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写；第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写；如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；若酶的编码基因位于噬菌体或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外的遗传成分；最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前三个字母用斜体表示。

第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin

dⅢ

属

种

株序Haemophilus

influenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系统名称内切酶系统名称R；甲基化酶系统名称M。例如R.HindⅢ，表示内切酶

M.HindⅢ，表示甲基化酶但现在限制性内切酶名称中的R省略不写。通常情况下，需要对克隆的DNA进行切割。首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因可能仅仅包含2-3kbDNA，则这个基因不得不从大的(通常情况下超过80kb)DNA分子中切割出来。其次，大的DNA分子不得不被切断成小的足以被载体携带的片段。绝大多数克隆载体能够承载的DNA片段处于一个特定的大小范围中。比如，以M13噬菌体为基础的载体，所克隆的DNA分子超过3kb时运载效率非常低。四、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征

Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性识别双链DNA分子中4--8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome)

。

GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口切口

：平端切口、粘端切口5’粘端切口GAATTCCTTAAG

EcoRⅠGCTTAAAATTCGCTCGAGGAGCTCCTCGAGGAGCTC

PstⅠ3’粘端切口DNA分子中识别序列的出现频率对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的DNA分子中,识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。这一算法假定核苷酸以一种随机方式排列而4个不同核苷酸以相同的比例出现(例如GC含量：50％)。一个四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256个核苷酸出现一次。实际上，这些假设不可能完全有效。如，λDNA分子，49kb，GC的含量要少于50％。对一个六核苷酸识别序列的限制性内切酶来说应该具有12个酶切位点。实际上，这些识别位点发生的频率要小一些，如：BglⅡ有6个，

BamHI有5个，

SalI则只有2个。同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAG

GATCCG++ATCTAG

GATCTA五、限制性内切酶的酶切反应条件1.为内切酶提供一个合适的环境(buffer)。所有限制性内切酶Ⅱ都需要在镁离子存在下才发挥作用。离子强度通常由氯化钠(NaCl)提供。绝大多数限制性内切酶的最适pH在7.4左右。不当的环境，不仅会降低限制性内切酶的活性，还会导致酶的专一性的改变，使DNA切割额外的、非标准的识别序列。2.限制性内切酶的用量供应商提供纯的已知浓度的溶液。1个酶单位：被定义为在合适的温度与缓冲液中，在20μL反应体系中，1h完全切割1μgDNA所需要的酶量。对于大量DNA的酶解，反应体积可按比例扩大，加入过量的酶（2～5倍）和较长的反应时间。3.反应温度：绝大多数，37℃时活性达到最大；一小部分需要不同的工作温度，如SamⅠ酶消化时，25℃才能达到酶的最大活性。BacⅠ酶消化时，50℃才能达到酶的最大活性。

4.酶解过程：

酶解体系的确定；成分的混匀；酶切反应；终止反应。

终止反应的方法：

如果酶切下来的DNA片段用于克隆实验，则反应中的酶应该消除掉以保证它不会意外地消化掉那些将在以后步骤中加入的其他DNA分子。“消灭”酶：

70℃保存很短的一段时间；苯酚抽提;

加入EDTA(鳌和Mg2+)或加入SDS使酶变性。5.限制性内切酶的酶切结果鉴定6.内切酶对DNA分子的不完全酶解：

完全酶切消化作用。

不完全酶切消化作用（构建基因组物理图谱、基因组文库及片段连接）。减少酶量，增加反应体系，缩短反应时间。六、影响限制性内切酶的活性的因素酶的纯度DNA样本的纯度DNA甲基化的程度酶切反应的温度和时间DNA的分子构型内切酶的缓冲液

如果内切酶处于非最适的反应条件下其识别序列位点有时会发生改变，这时产生错误切割的能力叫内切酶的星活性。高甘油含量内切酶用量过大低离子强度高pH值含有机溶剂Mn2+、Cu2+、Zn2+等非Mg2+的二价阳离子存在。第二节DNA连接酶DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键。DNA连接酶OHP5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick3‘…

C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’

T4-DNA连接酶DNA连接酶的基本性质连接多个平头双链DNA分子。DNA连接酶连接作用的分子机理连接酶与辅助因子ATP（或NAD+）提供的激活AMP形成一共价结合的酶－AMP复合物（腺苷酰酶）。同时释放出焦磷酸（Ppi）[或烟酰胺单核苷酸（NMN）]。激活的AMP从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5’－末端磷酸基团上形成DNA－腺苷酸复合物。3’－OH末端对活跃的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键将缺口封起来，同时释放出AMP。3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPT4DNA连接酶ATP酶-AMP+PPi大肠杆菌连接酶NAD+酶-AMP+NMN酶3‘…

C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C

…5’5‘…

G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’OHPAPDNA连接酶的反应条件Tris-HCl50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mM(不能大于1mM)DTTVolume10-20mlTT4-15℃4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindIII片段）所需的酶量1U酶已经足够DNA连接酶的种类T4噬菌体DNA连接酶分子量68Ku。是噬菌体基因30编码的产物，需要ATP作为辅助因子。应用最广。大肠杆菌DNA连接酶分子量75Ku。是大肠杆菌基因组中的lig

基因编码的产物，需要ATP作为辅助因子。不能连接平末端的两端片段。假阳性背景低。影响连接反应的因素温度

酶最佳反应温度37℃，在此温度下粘性末端之间氢键结合是不稳定的。连接反应最佳温度需介于两者之间。DNA末端的浓度

两个DNA末端间的连接可认为是双分子反应，标准反应条件下，其反应速率完全由相互匹配的DNA末端浓度决定。线性分子；环状分子重组子的构型与DNA浓度及DNA分子长度存在密切关系。小分子DNA片段易于分子内连接；较长DNA片段浓度降低有利于分子环化，浓度增加利于分子间连接。平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM第三节DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase）

能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖单核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。DNA聚合酶的分类

依据聚合酶使用的模板不同，将其分为两类：依赖于DNA的DNA聚合酶依赖于RNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(pol

Ⅰ)生物活性５’→３’ＤＮＡ聚活酶活性５’→３’外切酶活性３’→５’外切酶活性置换活性用途

５’ＣＣＧ-ＯＨ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’↓Mg2+

↓dNTPs

↓polⅠ↓５’ＣＣＧＡＴAGＣＴ３’３’ＧＧＣＴＡＴＣＧＡ５’５＇ＣＧＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇↓↓Ｍg2＋↓polⅠ↓

５＇ＣＡＴＣＴ３＇３＇ＧＣＧＣＧＴＡＧＡ５＇＋５＇pＣ＋５＇pＧ５＇ＣＧＣＡＣＴ３＇３＇ＧＣＧ５＇↓Ｍg2＋↓polⅠ↓↓５＇ＣＧＣ-ＯＨ３＇３＇ＧＣＧ-p５＇＋５＇pＡ＋５＇pＣ＋５＇pＴ

dNTPs

抑制５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓↓DNase

Ⅰ５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇↓

↓Ｍg2＋,

polⅠ,＊

dNTP↓５＇Ｃ-Ｇ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｔ３＇３＇Ｇ-Ｃ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ｃ-Ｇ-Ａ５＇５’→３’外切酶活性ＤＮＡ聚活酶活性用途

用切口平移方法标记ＤＮＡ用于cＤＮＡ克隆中合成第二链用于对ＤＮＡ分子的３’突出尾进行末端标记

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow

）Klenow酶的基本性质：大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。

Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。Klenow片段

补平限制酶切割ＤＮＡ产生的３’凹端用〔３２Ｐ〕dＮＴＰ补平３’凹端，对ＤＮＡ片段进行末端标记对带３’突出端的ＤＮＡ进行末端标记在cＤＮＡ克隆中，用于合成cＤＮＡ第二链在体外诱变中，用于从单链模板合成双链ＤＮＡ应用Ｓanger双脱氧末端终止法进行ＤＮＡ测序消化限制酶产生的３’突出端应用于ＰＣＲ技术Ｔ４噬菌体ＤＮＡ聚合酶

生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性3'→5'外切核酸酶活性交换（置换）反应用途

5‘CCGOH3'

3'GGCTACGA5'↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓dNTPs5'CCGATGCT3'3'GGCTACGA5'

5'CGCATCT3'

3'GCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓5'CGCOH3'3'GCG5'

+

5'pA

+

5'pC

+

5'pT

5'CGTCGCOH3'

3'GCAGCG5'

↓↓Mg＋＋↓T4DNA聚合酶↓[α-32P]dTTP5'CGOH3'3'GCAGCG5'↓↓5'CGT*OH3'

3'GCAGCG5'

补平或标记限制酶消化ＤＮＡ后产生的３'凹端对带有３'突出端的ＤＮＡ分子进行末端标记标记用作探针的ＤＮＡ片段将双链ＤＮＡ的末端转化成平端使结合于单链ＤＮＡ模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸TaqDNA聚合酶TaqDNA聚合酶是一种耐热的依赖于DNA的DAN聚合酶，最初从极度嗜热的水生菌中纯化而来。它具有2种活性，需Mg2+作辅助因子。５’→３’DNA聚合酶活性；５’→３’外切核酸酶活性。主要应用于PCR反应。逆转录酶

禽源逆转录酶和鼠源逆转录酶生物活性５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性ＲＮＡ酶Ｈ活性用途

类型性质

禽源逆转录酶鼠源逆转录酶来源

来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒(AMV)从一株能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)反转酶基因的大肠杆菌中发离得到的

肽链

两条多肽链

单链多肽

生物活性

无３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、强的ＲＮＡ酶Ｈ活性

无３'→５'外切核酸酶活性、聚合酶活性、弱的ＲＮＡ酶Ｈ活性

pＨ值

８．３７．６

５'→３'ＤＮＡ聚合酶活性

5'T

T

T

T

TOH3'3'AAAAAUCUGUCCUA5'↓↓Mg＋＋↓dNTPs↓逆转录酶

5'T

T

T

T

TAGACAGGAT3'

3'AAAAAUCUGUCCUA5'

ＲＮＡ酶Ｈ活性

RNA----5'UCCGUA3'

DNA----3'AGGCAT5'

↓逆转录酶↓

5'UC3'

3'AGGCAT5'

+

5'CGUA3'用途

逆转录酶主要用于将ｍＲＮＡ转录成双链ｃＤＮＡ在此反应中可用３种类型的引物：寡脱氧胸苷酸[12-18]聚体,oligodt特定序列的寡核苷酸标记带５'突出端的ＤＮＡ片段可用于双脱氧链终止法测序

DNA和RNA的修饰酶

末端脱氧核苷酸转移酶（terminaldeoxynucleotidyl

transf