微生物的遗传育种-诱变育种

项目二

微生物的遗传变异和育种

(Microbialgenetics

andbreeding)任务三诱变育种用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。

什么是诱变育种？诱变育种的2个主要环节：诱变（随机）选用合适的诱变剂和诱变剂量处理大量均匀、分散的微生物细胞，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中的突变频率大大提高。筛选（定向）设计有效的筛选方法，将少量正变株中的优良菌株挑选出来。诱变育种中的几个原则：(1)选择简便有效的诱变剂(2)挑选优良的出发菌株(3)处理单细胞或单孢子悬液(4)选用最适的诱变剂量(5)充分利用复合诱变的协同效应(6)利用和创造形态、生理与产量间的相关指标(7)设计高效的筛选方案(8)创造新型筛选方法1.诱变育种的设计前期准备工作单细胞悬液的制备诱变剂及诱变剂量的选择诱变处理突变体的分离与筛选优良菌株出发菌株的选择与纯化一、诱变育种的设计和准备2.前期准备工作

1.出发菌株的选择与纯化⑴对出发菌株的选择⑵出发菌株的纯化2.菌悬液(单孢子或单细胞悬液)的制备⑵菌悬液制备方法

①细菌前培养及诱变菌悬液制备同步化预培养35-37℃培养至对数期3-6℃培养1h20-24h培养基本培养基培养20-60min2℃保藏10min35-37℃培养至对数期加入一定浓度的嘌呤、嘧啶或酵母膏离心洗涤加入预冷的缓冲液或生理盐水悬液加入玻璃珠用无菌脱脂棉或滤膜过滤振荡10min调整浓度备用②产孢子的菌类预培养成熟而新鲜的孢子液体培养基中振荡培养孢子刚刚萌发（即芽长相当孢子直径0.5-1倍）②产孢子的菌类制备悬液

加入缓冲液或生理盐水振荡打碎孢子团块以脱脂棉或G3-G5玻璃过滤器过滤孢子计数调整浓度备用离心洗涤三种方法：a.菌丝尖端法③不产孢子的真菌上数滴培养基接上菌丝培养后菌丝生长延伸到盖片以外的培养基上，揭去盖片盖片周围部分尖端菌丝断裂b.单菌落周围菌丝尖端法选择数个单菌落紫外线照射或加入杀菌率低的化学诱变剂对菌落四周延伸的菌丝尖端处理培养筛选常用化学诱变剂c.混合处理法培养后相当年幼的菌丝体玻璃匀浆过滤小段菌丝的菌悬液进行处理3.诱变剂及处理剂量的选择

如：头孢菌素C产生菌的有效诱变剂是：uv

、LiCl2烷化剂；青霉素产生菌以烷化剂更合适。a.遗传稳定的出发菌株：以前未使用过突变谱较宽诱变率高

b.遗传性不稳定的出发菌株：自然分离原始菌株出发菌株环境条件突变体筛选效价高、性能好的一类菌落温和诱变剂处理选用的诱变剂是温和的或曾经是有效的诱变剂预实验：生产能力分类法最佳诱变剂的选择⑵诱变剂的种类（高效，简便）物理诱变剂：

频度低、大损伤，难修复，且操作简便；化学诱变剂：

频度高，点突变，易回复突变，操作麻烦。(NTG——超诱变剂）UV是最常用的一种诱变剂浓度、处理时间、处理条件照射源、照射距离、照射时间、处理条件⑶最适诱变剂量的选择

①诱变剂量的确定———突变剂量曲线②诱变剂对产量性状的诱变作用，大致有如下趋向：多少4.诱变处理⑴诱变处理方式复合因子适合于遗传性稳定的纯种及生活能力强的菌株处理，能导致较大的突变。先弱后强⑵诱变处理方法具体做法

适用于诱变力强而杀菌率低的诱变剂，或只对DNA复制起作用的诱变剂。出发菌株菌体的稀释液接种培养接种分离紫外线使用UV照射最为方便。取5ml单细胞悬液置于直径6cm的培养皿中，开盖照射；时间不短于10~20s，也不长于10~20min。挑选优良菌株15W、30cm5mL1.诱变育种筛选的基本环节三、突变株的分离与筛选设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.筛选方案⑴常规筛选程序2.筛选的程序将随机挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定⑵定向筛选程序改进之处：①预筛采用琼脂块法。②初筛摇瓶发酵液中产物的分析采用简便、快速的琼脂平板测定法。预筛部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性。如目标产物与色素之间具有一定相关性。⑴根据形态筛选变株3.菌落预筛的方法⑵根据平板菌落生化反应筛选变株定性和半定量检测⑶采用冷敏感菌筛选抗生素变株冷敏感菌是从人的病原菌中经诱变分离出的低温敏感变异株，在20℃下不能生长，可作为检验菌使用。诱变后的放线菌孢子悬浮液冷敏菌+混合20℃培养3-4d抗生素产生菌正常形成菌落37℃培养18-20h冷敏菌迅速生长形成抑菌圈菌落成熟且抗生素产量达高峰操作：⑷浓度梯度法一个菌株合成抗生素的水平与其耐自身产物能力大小有关。耐受性越强，抗生素产生能力也越强。抗生素稀释分离菌体细胞培养长出菌落挑取高浓度菌落双层法制成浓度梯度平板⑸应用影印技术快速筛选突变株筛选产脂野生株和具有高脂含量的突变株，需选择适合的染料合理设计培养基该法是日本学者八木建立的，而由Ichilawa等在春雷霉素产生菌选育中得到应用，取得令人满意的效果。⑹琼脂块法大通量筛选突变株四、营养缺陷型菌株的诱变和筛选凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。满足一切营养缺陷型菌株生长的天然或半合成培养基。在MM中有针对性地加入一或几种营养成分以满足相应营养缺陷型菌株生长的合成培养基。营养缺陷型的筛选三类培养基补充培养基（SM）[x]补充培养基（SM）[x]完全培养基（CM）[+]完全培养基（CM）[+]完全培养基（CM）[+]基本培养基（MM）[-]凡是能满足野生型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株(出发菌株)诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿逐个检出法影印接种法生长谱法1.营养缺陷型突变株的筛选步骤Auxo的浓缩中间培养2.营养缺陷型的诱变用于诱发营养缺陷型的诱变剂有亚硝基胍，紫外线、亚硝酸等。其中亚硝基胍诱发频率极高，一般可达10％。

3.中间培养（CM，培养过夜）目的：克服表型延迟表型延迟（phenotypiclag）：表型的改变落后于基因型改变的现象.

分离性延迟：突变的基因经DNA复制和细胞分裂后变成纯合状态，表型才能表现出来。

生理性延迟：

由杂合状态变为纯合状态，突变表型仍不能表现出来。4.淘汰野生型菌株⑴抗生素法适用于：细菌和真菌原理：青霉素、制霉菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：将菌培养在含抗生素的MM基中采用青霉素法淘汰野生型细菌的方法和步骤：⑵菌丝过滤法适用于：丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有野生型发育成菌丝；突变孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。⑶高温杀菌法适用于：芽孢菌原理：利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热的敏感性差异，野生型芽孢荫发，营养缺陷型芽孢不萌发。则加热后，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型保留下来。5.营养缺陷型的检出①点植对照法

②影印法该法效率高，适用于细菌、酵母菌及小型菌落的放线菌和霉菌。影印平板培养法母平板灭菌的丝绒印章另一选择培养基也称延迟补给法。本法用于细菌更为合适。③夹层法先出现④限量补充培养法6.营养缺陷型的鉴定⑴鉴定方法①在一个平皿中加入一种营养物质以测定多株缺陷型菌株(10-50株)对该生长因子的需求情况。②在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，称为生长谱法。⑵营养缺陷型鉴定步骤测定缺陷型菌株所需生长因子的类别具体测定缺陷该类别物质中的哪种生长因子用单一生长因子进行复证试验a.先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质。①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白陈，代表氨基酸类。②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均具有。③维生素混合物，代表维生素类。④核酸碱基混合液或酵母核酸(0.1％碱水解物)，代表嘌呤、嘧啶类。

缺陷型类别的测定b方法稀释后的菌悬液取0.1m1加入到基本培养中圆滤纸分别浸湿沾取以上四类代表物质1324缺陷型所需生长因子的测定以氨基酸缺陷为例进行说明,将18种氨基酸按右表分为6组特点：每2组只有一种共同物质组别化合物代号1178910112271213141533812161718449131619205510141719216611151820211352467.缺陷型菌的应用作为菌株的遗传标记：进行基因工程、诱变育种、研究代谢过程时