第三章 层析概况

做纯化似拂轻尘,制填料如煮小鲜

第三章层析概况2023/2/51层析法或称色谱法（chromatography）是一种物理或物理化学的分离分析方法。2023/2/52层析方法的分类：柱层析：名称原理基质或载体吸附层析疏水力和静电引力硅胶、氧化铝、羟基磷灰石、活性炭等分配层析、反向分配层析溶解度纤维素、硅藻土、硅胶等反向层析、疏水层析疏水力和静电引力苯基、辛基、丁基葡聚糖凝胶或C18离子交换层析离子间结合力树脂、离子型纤维素和葡聚糖凝胶，人造沸石。亲和层析亲和力带配基的葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶凝胶过滤层析排阻效应交联葡聚糖凝胶和交联琼脂糖凝胶聚焦层析电荷效应及离子间结合力多缓冲离子交换剂高效液相层析随固定相变化而变化离子交换，亲和，凝胶过滤等填料气相层析与吸附层析和分配层析同吸附剂或有机溶剂液膜2023/2/53薄层层析：纸层析：滤纸分配层析：溶解度，滤纸。名称原理基质或载体吸附层析疏水力和静电引力硅胶、氧化铝等分配层析溶解度纤维素、硅胶、硅藻土离子交换层析离子间结合力各种离子交换剂凝胶过滤层析排阻效应交联葡聚糖聚酰胺薄膜层析疏水力和静电引力聚酰胺2023/2/54一、常用术语：1、固定相：是由层析基质组成。基质包括固体物质（吸附剂、离子交换剂）和液体物质（固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。2、流动相：层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。在柱层析时，流动相又称为洗脱剂。在薄层层析时流动相又称为展层剂。3、层析：以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次的进行分配、吸附或交换作用，最终使混合物得到分离。4、操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数开表示。其数值大表示对某成分的结合力强。5、膨胀度：在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积用Vβ表示。即每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。第一节：柱层析2023/2/556、外水体积（Vo）：是基质颗粒之间的体积总和。7、内水体积（Vi）：是基质颗粒内部的体积总和。8、基质体积（Vg）：是基质自身所具有的体积。

Vo、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。9、床体积（Vt）：通常床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）。Vt是基质的外水体积Vo和内水体积Vi以及自身体积Vg的总合。

Vt=Vo+Vi+Vg10、洗脱体积（Ve）：是指某一组分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。11、分配系数和迁移率：分配系数是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示。而迁移率是指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值，常用Rf表示。K值越大，表明该组分与固定相的亲和力大，迁移率小。K值可以作为定性参数。2023/2/56二、基本原理A+BA+BABBA色谱法的分离原理主要是利用物质在流动相与固定相中的分配系数的差异而被分离。当两相相对运动时，样品中各组分将在两相中多次分配，分配系数大的组分迁移速度慢，反之迁移速度快而被分离。2023/2/57混合组分的分离过程及检测器对各组份在不同阶段的响应2023/2/58三、色谱参数色谱法中常用的参数包括：定性参数、定量参数、柱效参数、分离参数及相平衡参数等。1、色谱流出曲线：样品被流动相冲洗，通过色谱柱，留经检测器所形成的浓度信号随洗脱时间或洗脱体积而绘制的曲线，称为色谱流出曲线，即浓度-时间曲线。检测器（一）色谱流出曲线与色谱峰2023/2/592、基线（baseline）：检测器中只有流动相通过或虽有样品的浓度变化而不能被检测器所检出时，所给出的流出曲线称为基线。正常基线：基线的高低反映检测器的本底高低，基线主要由流动相中所含的杂质等因素决定。噪音（noise；RN）：各种未知的偶然因素引起的基线起伏的现象称为噪音。噪音的大小用噪音带的宽度来衡量。漂移（drift；d）：极限随时间朝某一方向的缓慢变化，称为漂移。主要由实验条件不稳定引起的。3、色谱峰（peak）或色谱带（band）：色谱流出曲线上突起的部分称为色谱峰。正常的色谱峰为对称形正态分布曲线，曲线有最高点，以此点的横坐标为中心，曲线对称地向两侧快速单调下降。不正常的色谱峰：拖尾峰及前延峰。对称因子（fs）：正常峰和不正常峰可用对称因子来衡量，

fs=（B+A）/2A峰高（或峰面积）：用于定量；峰位：用于定性；峰宽：用于衡量柱效。2023/2/510（二）定性参数1、保留时间：保留时间（tR）：从进样开始到某个组分的色谱峰顶的时间间隔，称为该组分的保留时间。死时间（t0）不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间称为死时间。调整保留时间：

tR`=tR-t02、保留体积（VR）：又称洗脱体积。保留体积：流动相携带样品进入色谱柱，由进样开始，到某个组分在柱后出现浓度极大值时，所需流动相通过色谱柱的体积。死体积：由进样器到检测器出口，未被固定相所占有的空间。包括管路，固定相颗粒间隙及检测器内腔等。死体积大，被分离组分扩散，色谱峰变宽。调整保留体积：扣除死体积后的保留体积称为调整保留体积。3、比移值（Rf）定时展开：薄层色谱中，一般都采用定时展开：观察同一展开时间中，组分与展开溶剂的迁移距离。Rf=l/l0定距展开：记录组分与流动相通过相同距离所需时间的展开方式，成为定距展开。在液相色谱中都采用这种方式。Rf=t0/tR2023/2/511（三）柱效参数色谱柱的柱效通常用理论塔板数或有效塔板数来衡量，而他们取决于区域宽度。1、区域宽度标准偏差（δ）：标准偏差的大小说明组分在流出色谱柱过程中物质的分散程度。δ小，则分散程度小，峰形窄、柱效高。反之，峰形宽，柱效低。半峰宽（W1/2）：色谱峰高一半处的峰宽。峰宽（W）：又称基线宽度。W=1.699W1/22023/2/512理论塔板数（n）：是衡量柱效的指标。理论塔板数取决于固定相种类、性质（粒度、粒度分布等），填充（或涂布）状况、柱长（或板长），流动相的流速及测定柱效（或板效）所用物质有关。在液相色谱法中还与流动相的种类性质有关。n=(tR/δ)2;δ=1/2.355×W1/2n=5.54(tR/W1/2)2理论塔板高度（H）：H=L/n2、理论塔板数与理论塔板高度塔板理论是把色谱柱假想为一个精馏塔，塔内存在许多塔板，组分在每个塔板的气相和液相间进行分配，达成一次分配平衡。然后随着流动相按一个塔板、一个塔板的方式向前移动。经过多次分配平衡后，分配系数小的组分，先离开蒸馏塔（色谱柱），分配系数大的组分后离开蒸馏塔（色谱柱），从而使分配系数不同的组分彼此得到分离。

2023/2/513范德姆特方程1956年，荷兰学者范德姆特（VanDeomter）等提出一个描述色谱柱分离过程中复杂因素使色谱峰扩宽而致柱效降低（即：使H增大）影响的方程。此方程经简化后写为:

A——涡流扩散项,

反映溶质分子受固定相颗粒障碍改变移动方向，形成涡流引起扩散。与填充颗粒的大小及填充的均匀性有关，而与流动相的流速无关。A越大，色谱峰变宽更严重。——

分子扩散项，溶质区带前后存在着浓度差，因而产生纵向扩散使区带（色谱峰）扩宽，扩散的严重与否，关键是取决于流动相的线速度。——固定相传质阻力项——流动相传质阻力项此两项对色谱峰的影响均与流速成正比。在流速很高的情况下，由于没有足够的时间建立平衡，偏离更为严重。U－流动相的平均线速度2023/2/514（四）分离参数1、分离度（resolution，R）：相邻两峰分开的距离是平均峰宽[(W1+W2)/2]的几倍，称为分离度。①分离效果差，柱效低，选择性（

）低②完全分离，柱效高，峰窄，选择性（

）低；③完全分离，选择性（

）增加，柱效低，峰宽④完全分离，柱效高，选择性（）好色谱分离中的四种典型情况R=2（l2-l1）/（W1+W2）2023/2/515R越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。R=1.5R=0.75R=1.0响应信号保留时间t,min2023/2/5162、色谱分离方程

R的定义并未反映影响分离度的各种因素。也就是说，R未与影响其大小的因素：柱效n、选择因子和保留因子k联系起来。

称为分配系数比（K2/K1）或容量因子比（k2/k1）abca项称为柱效项，柱效高则a项大。b称为柱选择项，c为柱容量项，这两项相关，受色谱柱性质及流动相性质影响。2023/2/517五、层析柱的制备与层析操作柱层析的设备：层析柱、部分收集器、恒流泵，检测器流动相检测器2023/2/5181、填料的选择：要分离物质的性质2、层析柱的选择：直径与柱长的比例：1:10-1:40层析柱的床体积是由要处理样品的量来决定的。3、填料的用量：一般为待分离样品的30-50倍。4、装柱：装填均匀，松紧一致，没有气泡。5、上样和洗脱：上样液体积小于床体积的1/2，体积越小越有助于分离效果。洗脱液的流速要恰当控制6、填料的再生：不同基质的再生方法不同。2023/2/519第二节、薄层层析薄层层析（thinlayerchroomatographyTLC）：是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。根据固定相的种类分类：吸附薄层层析分配薄层层析离子交换薄层层析优点：展层时间短15min-60min

设备简单，操作方便，既适于分析也适于制备影响因素少，结果重现性好显色方法多样，灵敏度高。2023/2/520操作及注意事项：1