无菌检查法修订版

无菌检查法樊春玲2013.6无菌检验

无菌实验的概念

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无菌检查试验是消费者和监督机构对无菌产品进行微生物学检查的唯一方法。无菌试验是用于检验一次性使用无菌医疗器械是否染有活菌的一种方法。本实验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。无菌检验无菌(活菌对人体的影响)如医疗器械消毒不彻底，即有活菌存在，当这些医疗器具使用人体，细菌即可进入血液或无菌组织中生长繁殖，造成继发性感染，可引发局部脓肿或全身感染，如菌血症和败血症等。使病人发生高热以及系列中毒症状，甚至危及病人生命，所以无菌性医疗器具标准规定了无菌。即指经消毒灭菌处理后，无任何活的微生物的存在，无菌检验应为无菌生长。无菌检验无菌(死菌对人体的影响)各种灭菌方法均可杀死微生物，但它的死体，碎片以新陈代谢产物(毒素)仍然存在，内毒素只有当死之后才释放出来。一般的消毒灭菌方法如热力等化学，物理因素对毒素没有破坏作用，在一旦使用此类产品，热原首先用于中枢神经，引起血管收缩，汗腺xian停止排汗，散热减少，分解代谢加强，产热增加，体温上升，热原进入人体后数分钟至1小时内，发冷寒颤，面色苍白，四肢冰冷，烦操不安等，持续0.5-1小时发生高热可达39-40℃，持续4-6小时昏迷死亡。这就是常见的热原反应。

无菌检验灭菌：灭菌室指杀灭或除去全部微生物。无菌；指产品上检不出活的微生物。产品灭菌有三种方法；热力灭菌(包括干热湿热)辐射灭菌环氧乙烷灭菌。实验室常用的几种方法：干热灭菌：火焰、烧灼、干烤高压蒸汽灭菌：耐高温和潮湿的物品紫外线灭菌：穿透力弱，用于无菌室、工作区空气灭菌或物体表面灭菌无菌试验消毒：对病原微生物的繁殖体的致死作用，但不能杀死芽孢等全部微生物。消毒室不彻底的，不能代替灭菌。主要消毒药有：乙醇、碘伏、新吉尔灭、氯和次氯酸盐无菌室要求无菌室环境洁净度10000级，无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。无菌室应在每周和每次操作前用75%乙醇或0.1%新洁尔灭或其他适宜消毒液擦拭工作台面及可能污染的死角，开启空气过滤器及紫外灯1小时。操作完毕，用消毒液擦拭工作台面，用紫外线灯杀菌不小于半小时。实验过程中应检查空气中的菌落数。无菌检验医疗器械的无菌检查目前依据GB∕T14233.2-2005和《中国药典》2005年二部附录中规定的方法。直接进入人体血液循环系统，肌肉，皮下组织或接触创伤，溃疡等部位二发生作用的制品或要求无菌的材料，灭菌器具等都要进行无菌检查。无菌检查并不是绝对的没有活菌，而是在产品一定的抽样数量中，考察其灭菌工艺，最灭菌达到10-6的微生物存活概率，就认定产品无菌。微生物限度检查包括细菌，真菌。阳性对照细菌阳性对照菌，以金黄色葡萄球菌为对照菌，真菌阳性对照以白色念珠菌为对照菌。使用仪器超净工作台，光学显微镜，恒温培养箱，压力蒸气灭菌器，集菌仪，电冰箱，干燥箱用具试管，注射器，量筒，三角瓶，移液管，集菌培养器，剪刀，镊子，接种环，酒精灯，无菌衣，帽，口罩，牛皮纸等。试剂75﹪酒精，新洁尔灭溶液，0.9﹪氯化钠，其他符合2010年版《中国药典》附录无菌检查法要求的稀释液和冲洗液实验准备试管，注射器，量筒，三角瓶，移液管，集菌培养器，剪刀，镊子，接种环，酒精灯，无菌衣，帽，口罩，牛皮纸等。试剂75﹪酒精，新洁尔灭溶液，0.9﹪氯化钠，其他符合2005年版《中国药典》附录无菌检查法要求的稀释液和冲洗液样品实验前的处理试管，注射器，量筒，三角瓶，移液管，集菌培养器，剪刀，镊子，接种环，酒精灯，无菌衣，帽，口罩，牛皮纸等。试剂75﹪酒精，新洁尔灭溶液，0.9﹪氯化钠，其他符合2010年版《中国药典》附录无菌检查法要求的稀释液和冲洗液实验前的准备操作人员用自来水洗双手，在用洗手液洗一遍，关闭紫外灯，进入缓冲间，换鞋穿无菌衣，将所需物品脱去外包装，移入无菌室，准备实验。无菌检查常用方法：

薄膜过滤法

直接接种法无菌检查法

直接接种法1配养基的制备

细菌，霉菌，按培养基的说明书根据需要称取干粉，按比列加蒸馏水，加热溶解在大烧杯中进行调节PH值，然后分装到试管中灭菌121℃40分钟。2预配养；细菌30-35℃培养48小时霉菌20-25℃培养72小时，如果无菌就可以使用。阴性对照不得有菌生长。3供试液的制备

管类器具；按管内表面积每10㎝流过管内腔1ml约10ml

容器类器具；如注射器可直接抽取公称容量做为供试液

小型配件；

如注射针可直接投放到培养基内。4取细菌培养基和霉菌培养基各接入一定量的供试液﹙各10管﹚培养及观察阳性对照培养48-72小时应生长良好，阴性对照不得有菌生长；细菌培养基在30-35℃培养，真菌培养基在23-28℃培养，各14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。

如果再接种后，或在在培养过程中培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天。观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。结果判断当阳性对照显浑浊并确有细菌生长时，可根据观察所得的结果判定。如细菌及真菌均为橙清或浑浊并非有菌生长判供试品符合规定。

如细菌及真菌培养基中任何1管显浑浊并证明有菌生长，应重试。若有菌生长判供试品不合格。薄膜过滤法利用集菌仪和3个一次性使用