第三章 核酸化学

第三章核酸化学唐巧玉2011年秋核酸作为遗传物质的证实与核酸的分类核苷酸结构与功能核酸结构核酸性质及研究方法第一节核酸作为遗传物质的证实与核酸的分类核酸是一类重要的生物大分子，担负着生命信息的储存与传递。核酸是现代生物化学、分子生物学的重要研究领域，是基因工程操作的核心分子。1核酸作为遗传物质的证实－－核酸的研究发现史1868年，F.Miescher（瑞士）首次在绷带上的脓细胞核中发现一种富含磷酸呈酸性又不溶于酸溶液的分子，命名为核素（nuclein

），其实是核蛋白。JohannFriedrichMiescherSwissbiochemist(1844–1895)PhysiologicalLaboratoryoftheUniversityofBasel1889年，R.Altman从酵母和小牛的胸腺中提取了一种溶于碱性溶液中的纯净物，这才是真正的核酸。从此，对核酸的研究全面展开，揭开了生物化学领域惊天动地的一页。1928年，GriffithF.首次发现肺炎双球菌（Streptococcuspneumoniae）的转化现象。FrederickGriffith(1879-1941)Griffith'sexperiments(1928)firstdemonstratedthatgeneticinformationcouldbetransferred.Withoutknowingwhatthisinformationwas,hecalleditthe"TransformingPrinciple".

1944年，OswaldTheodoreAvery等在离体条件下重复这一实验，并对转化本质进行了研究。①DNA的纯度越高，转化就越有效。②用DNA酶处理DNA，S型死细菌就不能使R型细菌发生转化。discovering1952年，Hershey&Chase用E.coli,phageT2做材料，利用同位素示踪法进行实验。AlfredD.Hershey（1908－1997）AlfredHersheyandMarthaChasedidtheHershey-ChaseblenderexperimentthatprovedphageDNA,andnotprotein,wasthegeneticmaterial.AlfredHersheyandMarthaChase（1928-2003）1953TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969Hershey-ChaseblenderexperimentDNA是遗传物质！！conclusion2核酸的种类和分布脱氧核糖核酸DeoxyribonucleicAcid（DNA）核酸分为两大类：核糖核酸RibonucleicAcid（RNA）

DNA真核原核98％核中（染色体中）线粒体（mDNA）叶绿体（ctDNA）拟核核外：质粒（plasmid）病毒：DNA病毒核外主要的RNA种类缩写全称功能存在mRNA信使RNA翻译模板所有细胞tRNA转运RNA氨基酸转运所有细胞rRNA核糖体RNA核糖体组分所有细胞hnRNA核内不均一RNA信使RNA前体真核细胞snRNA核内小分子RNA参与pre-mRNA剪接真核细胞snoRNA核仁小分子RNA参与per-rRNA加工真核细胞miRNA微RNA调节mRNA翻译原核细胞RNAi干扰RNA调节基因表达真核细胞第二节核苷酸结构1核苷酸的组成核苷酸核苷磷酸戊糖碱基嘌呤：A、G嘧啶：C、U、Tβ-D-2-脱氧核糖β-D-核糖1.1戊糖醛β-呋喃糖在溶液中β-D-核糖和β-D-2-脱氧核糖都可发生环状和直链分子的互换。但在RNA和DNA中只存在环状分子。β-D-2-脱氧核糖β-D-核糖1.2核酸分子中常见碱基嘧啶嘌呤衍生衍生1.3核酸分子中稀有碱基次黄嘌呤（Hypoxanthine）黄嘌呤（Xanthine）尿酸uricacid二氢尿嘧啶dihydrouracil7-甲基鸟嘌呤1.5核苷碱基与戊糖形成糖苷键，核苷具有高度亲水性和碱性条件下的稳定性。嘧啶核苷可抗酸水解，而嘌呤核苷易发生酸水解。核苷的构象顺式腺嘌呤核苷syn-adenosine反式腺嘌呤核苷anti-adenosineDNA和RNA中嘌呤核苷主要是反式构象顺式鸟嘌呤核苷syn-guanosine反式鸟嘌呤核苷anti-adenosinesyn-anti-嘧啶环O-2和戊糖C-5之间空间位阻，使得嘧啶核苷常为反式构象1.6核苷酸常见核苷酸常见脱氧核苷酸核苷酸的存在形式2核苷酸的功能①能量货币（ATP）②遗传物质合成的前体③信息转导中的信号分子④作为其它物质的前体或辅酶/辅基的成分⑤代谢活化的中间物⑥作为酶的别构效应物参与代谢调节⑦调节基因表达第三节核酸结构1核酸的一级结构5′未端3′未端核酸一级结构特征①核酸具有方向或极性②核酸在生理pH下带电荷③核酸碱基的有序性pA-C-G-T-AOH、pApCpGpTpA、pACGTA核酸的一级结构是指构成核酸链上的所有核苷酸残基或碱基的排列顺序核酸的一级结构书写方式有2DNA的二级结构1950年，Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物DNA作碱基定量分析，总结了DNA碱基组成“Chargaff规则”ErwinChargaff1905-20022.1Chargaff规则不同生物来源的DNA四种碱基比例关系DNA来源腺嘌呤A胸腺嘧啶T鸟嘌呤G胞嘧啶C（A+T）/（G+C）大肠杆菌25.424.824.125.71.01小麦27.327.122.822.71.21鼠28.628.421.421.51.33猪：肝29.429.720.520.51.43胸腺30.028.920.420.7脾29.629.220.420.8酵母31.332.918.717.51.079①不同生物来源的DNA碱基组成不同②同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同③同一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变④在所有生物的DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含量相同A=T，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同G=C。总的嘌呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同，即A＋G=C＋T。ChargaffRules2.2DNA双螺旋结构的揭示FrancisCrick(35y)1953JamesWatson(23y)丹麦哥本哈根剑桥大学CavendishLab.－－生命科学的重要里程碑RosalindElsieFranklin(1920-1958)

MauriceHughFrederickWilkins

2.3DNA的B-型双螺旋结构①DNA是由两条呈反向平行的多聚核苷酸链组成，一股链是5′→3′走向，另一股链是3′→5′走向。②链的骨架(backbone)由交替出现的亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双螺旋的外侧。碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。③一股链的嘌呤碱基与另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基配对(basepairing)。碱基互补配对总是出现于A与T之间(A=T)，形成两个氢键；或者出现于G与C之间(G=C)，形成三个氢键。④两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构，双螺旋的螺距为3.4nm，双螺旋每转一周为10碱基对（bp），碱基对层间的距离为0.34nm。双螺旋直径为2.0nm。2.2nmmajorgroove1.2nmminorgroove⑤表面形成一条大沟，一条小沟。

大沟与小沟是蛋白质识别DNA的碱基序列，与其发生作用的基础。ThehomeodomainoftheEngrailedproteinbindstoaparticularsiteintheDNA.Helix3contactsthebasepairsinthemajorgroove,whiletheamino-terminalportionofthehomeodomainenterstheminorgroove.TheHMG-I(Y)DNA-bendingproteinwrapsa60-base-paircoilofDNAaroundthetranscriptionalactivatorsNF-kB(thep50/p65complex),IRF1,andATF2/c-Jun.TheHMG-I(Y)isintheminorgroove,whiletheothertranscriptionfactorsoperateinthemajorgrooveofthedoublehelix.Oncetheenhanceosomeisassembled,itcontactsthebasaltranscriptionapparatusatseveralsites.结构回顾2.4A型双螺旋DNA在75%相对湿度的钠盐中形成A-DNA螺旋的构型。A-DNA螺旋是右手螺旋螺旋一周11bp，螺距2.46nm，螺旋直径2.6nm碱基平面与螺旋轴成19°夹角，大沟窄而深，小沟宽而浅。DNA与RNA的杂分子和RNA双链为A型双螺旋2.5Z-型双螺旋DNAZ-DNA螺旋是左手螺旋1979.AlecxanderRich美国麻省理工学院教授GCGCGC在高盐条件下形成可能的功能

与基因表达调控有关Z-DNA

(小沟极度窄而深，信息少)

基因关闭

B-DNA

(大沟很宽，深度中等,信息多)

基因表达

DNA的分子构型(B,Z,A)比较

FormBZAHelixDirectionRightLeftRightbp/circle101210.7Distance/bp~0.34nm~0.38nm~0.25nmDistance/helix3.4nm4.46nm2.8nmDiameter/helix2.0nm1.8nm1.9nmSequenceAnyPolyG-CAnyPolyC-APolyT-GPolyT-A

ConditionNormal4MNa+DNA-NaCryticD.SRNADNA/RNA

C2,C3/PuC2-endoC3-endo

GrooveMinorN7,C8outerMinorMajorMajorMinordeeper

deeperConformationA,G-antiA,G-synA,G-anti(dGMP,dAMP)C,T-antiT,C-antiT,C-anti

FormBZA2.6双螺旋稳定的力（ForcesthathelptoformtheDNAdoublehelix）氢键（Hydrogenbondingisnotthemostenergticallysignicantcomponentnote:maintenanceofdistancefromthetwophosphatebackbonerequiresPur-Pyr）碱基堆积力（Stackinginteractions-electronicinteractionsbetweenplanarbases）磷酸骨架的刚性（Rigidphosphatebackbone）离子键（Ionicinteractions-saltstabilizestheduplexformofDNAshieldingofphosphatebackbone）

疏水作用（Hydrophobicinteractions-highlynegativephosphatebackbonevs.nonpolarbases）2.7与DNA碱基顺序相关的特殊二级结构

回文序列指含有反向重复（invertedrepeat）碱基序列的一个DNA区域，DNA双链呈二重对称。①回文序列（palindrome）DNA片段旋转180°后，顺序不变回文序列中的单链可形成发夹结构双链可形成十字架结构这种发夹结构或十字架结构在大肠杆菌细胞DNA中已有发现②镜象重复（mirrorrepeat）结构镜象重复指每条DNA链内存在的反向重复序列③三股螺旋（triplexDNA,H-DNA）多嘌呤-多嘧啶的镜象序列可形成三螺旋结构(H-螺旋或Hoogsteen螺旋)参与三股螺旋DNA氢键的原子称为Hoogsteen位点，为有嘌呤的N-7、为O6和N6这种非Watson-Crick配对称为Hoogsteen配对三股螺旋（tripleDNA）可分为分子内的三股螺旋、分子间的三股螺旋和平行三股螺旋

1987年Mirkin.S.M

Nature330(495)证明plasmidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在

分子内的三股螺旋由于分子内的三股螺旋结构类似于“铰链”，因此，也称为HingeDNA，H-DNA。1957年Davis,Felsenfeld,Rich发现poly(U)+poly(U)+poly(A)T.SRNA

T.SDNA的概念1966年Miller&Sobell

实现RNA+D.SDNATriplepolyNt

但由于D.SDNA的提出而被忽视但因证明LacI产物为Repressor而被忽视asRepressor关闭基因

分子间的三股螺旋1987年Dervan.MoserScience238(645)合成S.SDNA+D.SDNA→T.SDNA

该种结构主要发生DNA分子重组交换过程中RecA蛋白促使ssDNA与序列相似极性相同的同源dsDNA发生交换形成的三股螺旋（tsDNA）叫R-DNA平行三股螺旋

l

S.S.DNA+D.S.DNAT.S.DNA☆

Pu+Pu/Py(偏碱性介质中稳定)☆Py+Pu/Py(偏酸性介质中稳定)常见类型

第三条链位于B-DNA的Majorgroove中与D.S.DNA一起旋转T.S.DNA可能的功能

a)T.S.DNA可阻止调节蛋白与DNA结合,关闭基因转录过程

b)T.S.DNA与基因重组,交换有关

加入第三条S.S.DNA作为分子剪刀(molecularscissors),

定点切割DNA分子

d)加入反义的第三条链(anti-sencepolydNt)终止基因的表达

e)相反的观点----T.S.DNA与基因表达呈正相关!?

④G－四股螺旋（Gtetraplex）多数真核生物细胞端粒3′端具有富含G的短重复序列形成四股螺旋，长度常为12-16bp。G－四股螺旋（Gtetraplex）的Hoogsteen氢键配对G－四股螺旋（Gtetraplex）存在平行式和反平行式由单链形成的四股螺旋双链四链3DNA的三级结构－－DNAsupercoiling超螺旋DNA三级结构的主要形式DNA双螺旋进一步扭曲盘绕形成新的螺旋，常称为DNA超螺旋（DNAsupercoiling）将一个螺旋结构的链分离引起超螺旋当DNA轴线没有弯曲时的状态称为松驰（relaxed）状态松驰状态松驰状态超螺旋2道和3道是利用拓扑异构酶处理的效果松驰状态螺旋程度逐渐增加DNA超螺旋分为正超螺旋和负超螺旋正超螺旋由DNA双螺旋过度缠绕引起。负超螺旋由DNA双螺旋缠绕不足引起。DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）拓扑异构酶I拓扑异构酶II切断DNA双链中一股并再连接断端，不需ATP供能使DNA双链同时发生断裂和再连接，需ATP供能。拓扑异构酶I切断DNA双链中一股并再连接断端拓扑异构酶Ⅱ可催化超螺旋的形成拓扑异构酶IIDNA双链同时发生断裂和再连接DNA超螺旋的生物学意义

DNA被压缩和包装，使其体积大大减小增加了DNA的稳定性可能与复制和转录的调控有关4RNA的结构与功能4.1RNA特点①碱基组成A、G、C、U（A＝U/G≡C，也有G＝U）不能配对区域形成突起稀有碱基较多，稳定性较差，易水解②多为单链结构，少数局部形成链内螺旋③分子较小,一般含几十至几千个核苷酸主要的RNAmRNAtRNArRNA4.2tRNA占RNA总量的15％，一种氨基酸对应最少一种RNA。分子量25000左右，大约由73－94个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。分子中含有较多的修饰成分。3'-末端都具有CpCpAOH的结构。功能：tRNA：转运RNA，负责运送氨基酸tRNA的二级结构“三叶草（cloverleaf）”结构四环四茎四臂氨基酸臂：CCAD环：含D核苷（二氢尿嘧啶）反密码子环：阅读mRNA密码，5′端总是“U”，3′端总嘌呤核苷残基TΨC环：含假尿嘧啶（ψ），核糖体与tRNA结合的识别位点额外环：区分不同tRNA的标志tRNA三级结构倒“L”结构4.3rRNA原核生物真核生物核糖体rRNA核糖体rRNA

30s70s

50s16s5s、23s

40s80s

60s

18s5s、5.8s、28s占RNA总量的80％rRNA的二级结构也呈茎环结构大肠杆菌5SrRNA的二级结构模型rRNA三级结构4.4mRNA占细胞总RNA的3％～5％

3‘-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5’-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为“帽结构”。真核细胞mRNA5真核生物细胞DNA的高级结构5.1真核生物染色体结构层次①DNA双螺旋结构（2nm）④一环（突环，75000bp）②核小体组成的10nm“串珠”结构③30nm纤丝⑤玫瑰花环（6个一环）⑥螺旋（超螺线管，30个玫瑰花环）⑦染色体（10个超螺线管）第四节核酸性质1一般的理化性质③两性解离/一般呈酸性（在中性溶液中带负电荷），可用电泳或离子交换（色谱）进行分离②线性大分子（粘度高。抗剪切力差）④室温条件下，DNA在碱中变性，但不水解，RNA水解⑤加热条件下，D－核糖＋浓盐酸＋苔黑酚绿色D－2－脱氧核糖＋酸＋二苯胺蓝紫色①微溶于水，不溶于有机溶剂2核酸的紫外吸收特性在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。以A260/A280进行定性、定量分析3变性（Denaturation）DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象叫DNA变性DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后转化成柔软而松散的无规则单股线性结构，因此粘度明显下降。①溶液粘度降低变性表征变性后整个DNA分子的对称性及分子构型改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。②旋光性发生变化DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。③紫外吸收增强增色效应(hyperchromiceffect)指DNA变性后其紫外吸收明显增强的效应。维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。导致DNA变性的因素加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等凡能破坏双螺旋稳定性的因素，DNA变性的本质

DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解温度，用Tm表示。①DNA的均一性DNA的均一性DNA分子组成均一性Poly(A-T)P