第七章 细胞介导的免疫应答

第七章细胞介导的免疫应答教学内容1、掌握免疫应答的基本概念学时：42、掌握免疫应答的基本过程3、了解细胞凋亡和免疫免疫系统的主要功能是识别自身和非自身的抗原物质，并对识别的物质产生免疫应答，从而保证机体内环境的稳定。免疫应答是由抗原引发的，由多种免疫细胞参与的一系列反应。首先是APC将经过加工的抗原提呈给相应的T细胞(Th或CTL)，使之活化，通过细胞膜上的分子或分泌的细胞介素进一步活化诸如B细胞、NK细胞、粒细胞、CTL、巨噬细胞等细胞，产生相应的免疫效应。还可直接通过CTL杀伤靶细胞或诱导靶细胞凋亡。并通过补体成分及细胞因子介导炎症反应，促进对抗原和靶细胞吞噬，最终清除抗原。

一、免疫应答的非特异性和特异性二、主动免疫、被动免疫和过继免疫三、无应答第一节免疫应答的基本概念一、免疫应答的非特异性和特异性1、非特异性免疫应答

凡在生物进化过程中形成的、相对稳定、无特殊针对性的对病原菌的天生抵抗力，称为非特异性免疫或先天免疫或自然免疫。

非特异性免疫的特点：

无特异性、天生性。非特异性免疫屏障结构

炎症反应吞噬细胞的吞噬作用

正常组织和体液中的抗菌物质

机体的非特异性免疫主要包括四个方面：2、特异性免疫应答是机体受到抗原刺激后，激活相应的淋巴细胞，从而导致一系列的免疫应答反应。反应过程中由于抗原提呈细胞对抗原进行限制性加工处理及特异性提呈以使相应的B细胞和T细胞克隆产生特异性识别，所以称为特异性免疫应答。

特异性免疫应答又称适应性免疫应答，它具有针对不同抗原(包括病原生物)的侵入而作出的相应应答的特征。由于是后天获得的，不能遗传给后代，又称为获得性免疫或后天免疫。特异性免疫的特点：

获得性、特异性和记忆性。特异性免疫应答可分为两种类型：由抗原提呈和T细胞特异识别开始，经过效应T细胞、巨噬细胞等效应细胞介导的免疫应答称为细胞免疫应答。特异性免疫的类型体液免疫细胞免疫由B细胞上的抗原受体(mIg)识别抗原，诱发产生抗体的应答称为体液免疫应答。能特异性识别抗原的T细胞克隆，是因为它有特异性抗原受体TCR。受到抗原刺激后T细胞开始活化，活化的T细胞大多分化发育成效应T细胞(如CTL)。少数活化的T细胞分化为记忆T细胞。记忆T细胞保持其原有的特异性，当再次接触到相同抗原时能迅速作出免疫应答反应。记忆T细胞可在个体之间人工转移。二、主动免疫、被动免疫和过继免疫

特异性免疫依其来源可分为三类：主动免疫被动免疫过继免疫1、主动免疫

是机体在自然条件下因病原菌侵染或通过人工预防接种后在体内形成的特异性免疫力。当受免疫的个体再遇到相同的抗原刺激时便会作出强烈的免疫应答。主动免疫的有效免疫时间不等，如白喉、天花和流行性腮腺炎可诱导长期的免疫力，而流行性感冒只能产生短期的免疫力。2、被动免疫是通过输血、输入淋巴细胞、注射血清组分或哺乳将现成的特异性抗体输入未经免疫的个体，而使其获得的免疫力。例如注射破伤风抗毒素、注射乙肝疫苗等。被动免疫随着输入的抗体在体内被代谢消失，免疫力也消失。

3、过继免疫

过继免疫是通过转移免疫的淋巴细胞将免疫性转移到一个未免疫的个体，使其具有与供体相同的特异免疫性。所转移的T细胞是具有特异性的、活化的淋巴细胞，包括记忆性淋巴细胞。过继免疫也是被动的，但与被动免疫不同的是过继免疫转移免疫性是通过淋巴细胞而不是通过抗体。

抗原不是任何情况下都会诱导机体产生免疫应答。当淋巴细胞缺失时，机体不会产生免疫应答，这可能是机体本来有免疫缺陷，也可能是诱导发生的淋巴细胞生理性凋亡造成的。三、无应答

无应答是免疫耐受现象，是指淋巴细胞虽然存在，但由于受到抑制，对免疫原的再刺激不能作出反应。自身抗原、肿瘤抗原有时会表现无应答。当条件改变之后自身抗原可能诱发免疫应答而发生自身免疫病。机体有时对一些肿瘤和慢性病毒表现无应答，这是病理性的无应答。因此，打破病理性无应答在免疫治疗方面具有重要的意义。第二节免疫应答的基本过程

免疫应答的基本过程包括机体中抗原提呈细胞对抗原摄取、加工、并将抗原提呈给T、B淋巴细胞，使淋巴细胞活化、增殖、分化、并成为效应细胞，发生免疫反应，最终清除抗原物质。这是一个过程十分复杂的动态过程。一、抗原提呈细胞二、T细胞活化三、外源性抗原免疫应答四、内源性抗原免疫应答一、抗原提呈细胞

抗原提呈细胞是指能表达MHC-Ⅱ类分子，并能将抗原加工提呈给免疫应答细胞的细胞。主要有：单核细胞、各种巨噬细胞，B细胞、树突细胞及内皮细胞等。

免疫应答是从抗原提呈细胞对抗原的摄取、加工、并提呈给其他淋巴细胞开始启动的。抗原提呈细胞都有一个共同的特征，即都能表达MHC-Ⅱ类分子，这是抗原提呈的重要分子。

单核细胞和巨噬细胞都来源于骨髓干细胞，骨髓中的髓样干细胞在多种集落刺激因子(CSF)、IL-2、IL-4以及IFN等因子的作用下，诱导分化成单核细胞，并进入血液循环，然后，穿过内皮细胞层移行至全身各种组织，形成具有组织特异性的巨噬细胞。1、单核细胞和巨噬细胞树突细胞是一类非常重要的抗原提呈细胞，无吞噬功能，但其表面表达较高密度的MHC-Ⅱ分子，且由于有较多树状突起，表面积较大，有利于抗原提呈。2、树突细胞

随着抗原的来源和性质不同，其加工和提呈的途径也不同，蛋白质抗原可分为内源性抗原和外源性抗原两大类，这两类抗原的免疫应答过程是不同的。3、内源性抗原和外源性抗原外源性抗原：是指外来的抗原，包括各种微生物体、各种蛋白质分子等。内源性抗原：主要由自身细胞器合成，如病毒抗原、肿瘤抗原及自身分子突变的抗原等。但同样是病毒，灭活的，无感染性的病毒抗原通过外源性抗原加工提呈途径，而活病毒则通过内源性抗原提呈途径。二、T细胞活化

免疫应答的重要过程是淋巴细胞的活化，而T细胞的活化是细胞介导的免疫应答中不可缺少的内容。T细胞活化主要表现为细胞分裂增殖，克隆扩增，分化为效应细胞并执行各种功能。如Th辅助B细胞分泌抗体的功能，Tc有杀伤靶细胞和诱导靶细胞凋亡的功能。（1）抗原提呈细胞(或靶细胞)表面MHC/抗原肽复合物与T细胞表面的TCR结合为第一信号；（2）抗原提呈细胞表面B7分子与T细胞表面CD28分子结合形成第二信号；（3）IL-1和IL-2等细胞因子是T细胞活化的第三信号。三种信号对T细胞活化过程缺一不可。1、T细胞抗原诱导活化T细胞抗原诱导活化的三个基本条件：CD3作为与TCR紧密联系在一起的辅助分子，是将TCR信号传入T细胞的不可缺少的分子。IL-1是巨噬细胞等APC产生的细胞因子。它与其他信号一起可以刺激T细胞分泌IL-2。IL-2是T细胞生长因子，IL-2和T细胞表面IL-2受体的产生是T细胞活化的重要标志。T细胞抗原诱导活化的其它因素：因此，T细胞既分泌IL-2，又具有IL-2受体，就形成了自分泌活化扩增信号的正反馈放大，使被活化的T细胞克隆得到快速扩增活化。

T细胞除可经抗原特异性途径诱导活化外，还可以经过非抗原途径诱导活化或抑制。2、T细胞非抗原诱导活化（1）植物凝集素：如植物血凝素(PHA)，伴刀豆蛋白A(ConA)及商陆有丝分裂素(PWM)等可以使大量休止期T细胞克隆活化。（3）小分子物质：对T细胞活化具有较大的影响，如钙离子载体A23187和离子霉素可以加强T细胞活化，而环孢素A和糖皮质激素则可抑制T细胞活化，并作为重要的免疫抑制药用于临床。（2）单克隆抗体：可以与TCR的不同结构域结合并产生T细胞活化效应或相反效应，阻断抗原对T细胞的活化。（2）TCR蛋白激酶C(PKC)途径。（1）CD28蛋白酪氨酸激酶(PTK)途径。3、T细胞活化的主要过程T细胞接受抗原刺激后，膜信号通过蛋白激酶系统传向胞内，可分别通过两条途径激活：两条途径均可激活JNK蛋白激酶(JNK-1)。TCR途径激活磷脂酶C(PLC)导致IP3增高，使内质网Ca+2释放导致胞质钙增高，进一步激活钙调磷酸酶，它与JNK通过DNA结合蛋白启动IL-2基因的转录，分泌IL-2作为T细胞生长因子，又可与T细胞自身IL-2受体结合，形成正反馈增殖放大，从而活化T细胞。外源性Ag是通过MHC-Ⅱ分子提呈的。三、外源性Ag免疫应答

APC中内质网上新合成的MHC-Ⅱ分子，在无抗原肽时，是与内质网上的恒定链分子结合的。1、MHC-Ⅱ分子的表达外源性Ag经过APC的内吞作用，形成内粒体进入胞质。内粒体中含多种水解酶，可将抗原水解成含12-20氨基酸的肽段。随后，恒定肽被降解，囊泡继续向胞质外移动，最终与细胞外膜融合，从而使结合有抗原肽的MHC-Ⅱ分子表达于APC表面。MHC-Ⅱ与恒定链的复合物随着内质网膜移动，形成囊泡，并与内粒体融合，然后，MHC分子上的恒定链被抗原肽取代，形成MHC-Ⅱ与抗原肽的复合物。（1）MHC-抗原肽-TCR复合物：APC表面MHC-Ⅱ与抗原肽结合形成复合表位，共同被Th识别，T细胞表面的TCR及其共受体CD4以及膜内信号传递分子CD3在Th细胞膜上形成复合物，APC上MHC-肽复合物与TCR结合，同时被CD4识别结合，形成MHC-抗原肽-TCR复合物，称为第一信号，从而将细胞活化信号传入Th细胞内。2、Th的活化

MHC-抗原肽-TCR复合物的形成具有高度的特异性，MHC对抗原的结合具有一定的选择性，而这两者结合后形成的复合表位对TCR又有高度选择性识别和结合，这种识别又称MHC限制性识别。（2）B7-CD28复合物：Th活化还需要APC表面的B7分子与T细胞表面的CD28分子结合形成复合物，称为第二信号。只有当MHC-肽-TCR信号与B7-CD28两种信号共同存在时，才能刺激T细胞活化、增殖。（3）细胞因子：T细胞活化增殖分化还需要各种细胞因子的作用，称为第三信号。细胞因子对促进细胞表面受体的表达，对应答的启动和放大非常重要。

这三种信号缺一不可，如只有第一信号没有第二信号，则可导致被刺激的T细胞死亡或出现免疫耐受，而只有第二信号则无反应。Th细胞被APC激活后，开始分裂增殖，并产生一些细胞因子，如IL-2、4、5、6、IFN-γ，并表达一些膜分子，如IL-2受体(IL-2R)、CD40L等。CD40L可以与巨噬细胞、B细胞等表面表达的CD40分子结合、使巨噬细胞和B细胞活化。3、B细胞的活化巨噬细胞活化后分泌IL-1、7、10，并与Th细胞分泌的IL-4、5、6和IFN-γ共同对B细胞增殖分化成浆细胞，分泌抗体起重要作用。抗体的特异性来自于BCR对抗原的特异性亲和力，以致特异性B细胞才能得以接受并加工、处理特异性Ag，但是作为TD-Ag，被B细胞或巨噬细胞加工后，只剩下一些MHC-Ⅱ分子结合的抗原寡肽段被提呈给Th细胞，以产生反馈性的活化该特异性B细胞克隆的信号，并使B细胞分化成浆细胞，产生Ab。特异性的Ab产生后，可引起一系列的免疫效应。（1）中和抗原Ab与抗原特异性结合形成免疫复合物沉淀，可被吞噬细胞吞噬清除。4、Ab的免疫效应

由于巨噬细胞、嗜中性粒细胞表面均有Fc受体表达，当抗体的Fab区与Ag决定簇结合，而Fc端与Fc受体结合后，吞噬细胞可以准确的吞噬Ag物质，并将其消灭，这个过程称为调理作用。（2）抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用即ADCC。多种白细胞如Tc、NK细胞、单核巨噬细胞及嗜中性、嗜酸性粒细胞表面都有Ab的Fc受体，当Ab与这些细胞表面Fc受体结合后，在遇到细胞性抗原时，白细胞通过Ab与靶细胞紧密结合，并将靶细胞裂解。（3）抗体介导的补体依赖的细胞毒作用即CDC。Ab可以通过经典激活途径激活补体，最终使补体成分在靶细胞膜上形成孔洞，使靶细胞裂解。内源性Ag在内质网上合成后，在胞质中被多蛋白酶复合物(LMP)水解成8-11肽，然后被依赖ATP的抗原肽载体(TAP)运送至MHC-Ⅰ分子，与MHC-Ⅰ分子及β2m分子结合，随着内质网和高尔基体膜移动，最后与细胞外膜融合而表达于细胞表面。四、内源性Ag免疫应答

内源性Ag包括病毒、肿瘤和自身突变抗原等，是通过MHC-Ⅰ分子完成免疫应答的。1、MHC-Ⅰ分子的表达

当MHC分子α链(重链)刚合成时，首先与内质网上钙联蛋白分子结合，当抗原肽和β2m分子到达时，钙联蛋白解离。钙联蛋白与MHC-Ⅰ分子上的恒定链功能相似，有分子伴侣作用。MHC-Ⅰ类分子与抗原肽结合后形成复合表位，共同被CD8+的Tc表面TCR识别和结合。抗原肽表位与TCR的结合具有高度特异性，只有具有与抗原肽相匹配的TCR的Tc细胞克隆才能与提呈抗原的细胞结合而发生免疫应答。2、Tc细胞的活化具有独特型的Tc细胞克隆数量少，处于休止状态。当携带有MHC-Ⅰ分子和抗原肽的APC与Tc的TCR结合并在复合刺激信号B7-CD28的协同作用下可激活前体Tc细胞。巨噬细胞分泌的IL-1也起一定作用，可激活T细胞表达IL-2受体。

CD4+Th细胞分泌的细胞因子如IL-2、4、12、INF-γ等对Tc细胞增殖、分化、成熟起着重要作用，当前体Tc细胞活化后，其细胞内基因表达调控发生一系列的变化，如细胞内合成许多颗粒酶、穿孔素、TNF、IFN-γ及Fas配体(CD95L)。Tc发挥效应依赖于与MHC-Ⅰ分子介导的含有特异抗原肽的靶细胞的接触，及一些非特异性粘附分子与靶细胞相互作用。当Tc与靶细胞通过膜紧密接触时，Tc细胞内的裂解颗粒将细胞毒素颗粒定向释放至靶细胞，颗粒内的穿孔素，可集中到靶细胞膜上，形成直径16nm的孔道，使细胞内外相通，造成靶细胞内含物外泄而死亡。Tc细胞每次仅裂解一个靶细胞，当杀伤一个靶细胞后，又指向另一个靶细胞，而自身不受损伤，也不损伤其他细胞。Tc细胞杀伤靶细胞的另一个机理是通过其表面表达的FasL与靶细胞表面的Fas(CD95)分子的结合，从而启动靶细胞凋亡。Tc细胞对靶细胞杀伤有以下三个特点：（1）具有抗原特异性和MHC-Ⅰ分子限制性。由于MHC-Ⅰ分子表达于所有有核细胞，防御范围广；但在效应期，Tc又受自身MHC-Ⅰ分子约束，只对自身表达MHC-Ⅰ分子的细胞内感染、突变抗原、自身抗原起到监视作用，不杀伤异体MHC-Ⅰ分子介导的靶细胞。（2）直接接触。杀伤过程需要与靶细胞直接接触，不伤害其他无关细胞。（3）反复杀伤。可反复杀伤表达MHC-Ⅰ分子及相应特异抗原的多个靶细胞而不损伤自身。少数MHC-Ⅱ分子介导的Th也可通过表达FasL以诱导靶细胞凋亡。

第三节细胞凋亡与免疫

一、细胞凋亡二、细胞凋亡的检测

三、细胞凋亡与免疫

因环境因素突变或病原物入侵而造成的细胞死亡，称为病理死亡，或细胞坏死。

因个体正常生命活动的需要，一部分细胞必定在一定阶段死去，称细胞凋亡。

细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化是与免疫细胞正常死亡相统一的，而免疫应答的效应过程是与靶细胞死亡相伴随的。1972年，Kerr等提出细胞凋亡不同于坏死、是主动的、自我破坏的过程。1980年，Wyllie等用糖皮质激素诱导T细胞死亡时，观察到细胞发生的一系列变化与细胞坏死不同，认为这是细胞内基因调控引起的、有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡(PCD)（或细胞凋亡）的概念。凋亡是多细胞生物生长发育、协调体内环境，完成一定生理机能的需要，对于机体免疫具有特殊意义。免疫系统识别功能的形成，必须删除对自身起反应的淋巴细胞，而这种删除过程主要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过诱导靶细胞凋亡来实现的。一、细胞凋亡细胞凋亡过程如出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)、免疫缺陷等。1、细胞凋亡a、细胞形态变圆失去微绒毛，与周围细胞脱离；（1）细胞凋亡的特征b、内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合；e、细胞体积变小，细胞膜内陷将细胞分割为凋亡小体。c、染色质压缩呈半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解。d、DNA被核酸内切酶降解为大小不一、呈梯度变化的寡核苷酸片段。a、脱落离开生物体；（2）细胞凋亡的结局b、被吞噬细胞及周邻细胞吞噬清除。凋亡是在生理因素的诱导下发生的，不会引起炎症反应。凋亡过程需要新的基因转录和蛋白质合成，是一个需要能量的主动过程。2、细胞坏死a、细胞膜通透性增加，细胞肿胀或发生不规则变化。b、内质网、线粒体等细胞器扩张、溶酶体破坏。d、细胞膜破裂、胞质外溢、并释放到周围。c、细胞核DNA和胞质内容被无规律的随机降解。（1）细胞坏死的特征f、崩溃的细胞碎片被巨噬细胞吞噬清除。（2）细胞坏死的结局细胞坏死是非生理因素造成的损伤过程，可引起正常细胞严重的炎症反应。细胞凋亡与坏死的主要区别

细胞凋亡细胞坏死诱因为生理因素非生理因素造成的损伤需要能量不需能量有新的基因转录及蛋白质合成无基因调控DNA呈梯度降解DNA无序降解细胞膜内陷分割形成凋亡小体细胞肿胀溶解细胞器完整，染色质均一凝集细胞器破裂，染色质不均一不发生炎症反应发生严重炎症反应二、细胞凋亡的检测

应用形态学、生物化学、分子生物学、免疫学方法都可将凋亡细胞与活细胞及坏死细胞区分开来，部分方法可对凋亡细胞进行定量分析，常用的方法包括:细胞凋亡的检测形态学检测方法

免疫学检测方法

生物化学检测方法

1、形态学检测方法（1）利用光学显微镜直接观察细胞大小、形态、细胞器、凋亡小体及核染色质结构等。（2）染料拒染试验台盼蓝：可使死细胞着色，活细胞不着色。荧光染料：碘化丙啶(PI)可使死细胞染色，在紫外光下发红荧光，而活细胞和凋亡细胞不被染色。二乙基荧光素和双苯胼咪唑(Ho)可被活细胞及凋亡细胞吸收，水解后二乙基荧光素在紫外光下发绿荧光，Ho发蓝荧光，经流式细胞仪分析，可将PI和Ho染色分开，从而可以区分凋亡细胞和坏死细胞。2、生物化学检测方法细胞凋亡时染色质浓缩，DNA在核小体之间的连接处被核酸内切酶切断，形成相差180~200bp长度左右的DNA梯度片段，经琼脂糖电泳，再用溴化乙啶染色后，在紫外光下可以观察到典型DNA梯度片段。也可先以3H-TdR在细胞培养时掺入标记DNA，再将细胞处理，用离心法将大分子DNA和小分子DNA分开，分别测定其放射活性，计算凋亡细胞百分率。

3、免疫学检测方法有时凋亡细胞数较少，用DNA梯度分析法难以检测，必须用更灵敏的方法。酶联免疫分析法(ELISA)：是将抗组蛋白抗体吸附于酶标测定板，再加入待测细胞裂解物的上清液，使核小体与抗组蛋白抗体结合，洗去未结合的各种分子，最后加入酶交联标记的抗DNA抗体——过氧化物酶，此抗体与核小体上DNA结合，再加入过氧化物酶的底物如二氨基联苯，过氧化物酶可催化其脱氢氧化而显棕色，在酶标分析仪上测定OD405值，与对照相比可定量分析凋亡细胞。ELISA的优点：(1)灵敏度高、需要的细胞数少、最低可检测到50个细胞凋亡，且可同时对多份样品进行检测。(2)抗体无种属特异性，可测定不同种属的细胞凋亡。(3)测定方法简便，不需要预先标记细胞。细胞凋亡的检测方法还有许多，基本原理主要有以下几方面：（1）形态学改变；（2）细胞通透性改变；（3）DNA梯度降解分析；（4）细胞凋亡相关的膜表面分子的检测。三、细胞凋亡与免疫

免疫系统中的细胞和分子具有高度多样性，以应付自然界千差万别的抗原物质，发挥免疫效应。这些免疫细胞和分子能精确的识别和区分外来物和自身物质，从而清除外来抗原物，维持自身的稳定。机体对外来抗原的选择识别能力来源于免疫系统分化发育过程中对淋巴细胞的选择和删除。通过基因重排产生各种T细胞和B细胞克隆，而通过细胞凋亡消除对自身有反应的淋巴细胞克隆，从而形成对自身的免疫耐受，如果此过程出错，则可能引起对自身抗原的免疫应答或对外来抗原无应答。1、细胞凋亡与淋巴细胞发育及克隆选择

T细胞来源于骨髓造血干细胞，造血干细胞在骨髓中分化为原T细胞，再发育成前T细胞。前T细胞为双阴性细胞(CD4-CD8-)，CD3也为阴性。前T细胞进入胸腺后，在胸腺微环境作用下，发育成双阳性细胞(CD4+CD8+)，同时细胞内TCR基因发生重排，形成各种TCR并表达于CD4+和CD8+T细胞表面。（1）T细胞的发育和克隆选择如果这些重排的TCR不能与MHC匹配，则不被选择，并发生细胞凋亡，这个过程称为阳性选择，胸腺中阳性选择使T细胞获得MHC限制性识别能力，从而删除了不受MHC限制的T细胞。T细胞与胸腺皮质上皮细胞表达的MHC-Ⅰ或Ⅱ类分子结合则被