第1讲 基因工程导论 应用和安全性管理 2012

基因工程

geneticengineering生物工程微生物工程基因工程细胞工程酶工程绪论学科诞生的理论和技术基础基因工程的概念和研究内容基因工程的应用和发展基因工程的研究动态基因工程技术诞生的3大理论基础▼

20世纪40年代，O.T.Avery发现生物遗传信息的化学本质是DNA而非protein(肺炎球菌转化实验)

▼20世纪50年代，Watson-Crick提出DNA的双螺旋结构模型；半保留复制机理；解决了基因的自我复制和传递问题

▼20世纪60年代，相继提出“中心法则”和操纵子学说,成功破译遗传密码43，阐明遗传信息的流向和表达问题20世纪40-60年代的3大理论发现，从理论上确立了基因工程的可能性，但在进行基因工程技术操作时，

科学家仍面临3个基本技术问题：①如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需要的基因片段切割下来；②如何将所切割下来的DNA片段进行繁殖扩增；③如何将所获得的基因片段重新进行连接。

▼“基因剪刀”－限制性内切酶

1970年H.O.Smith和K.W.Khorana在流感嗜血杆菌(Haemophilusinffuenzae)中分离纯化了第1个核酸限制性内切酶HindⅡ1972年H.W.Boyer实验室首先发现EcoRI核酸内切酶

基因工程技术诞生的5大技术基础

1970年Baltimove和Temin等同时各自发现了逆转录酶，完善了遗传学中心法则，使真核基因的制备成为可能▼逆转录酶1、真核基因组庞大而复杂，基因图谱不易制得，2、基因多有内含子，不能在原核表达系统剪接出成熟的mRNA，难以获得相应的产物，逆转录酶的用途：mRNA→cDNA(complementoryDNA）→构建文库、分离目的基因▼连接酶

1967年世界上5个实验室几乎同时发现DNA连接酶：该酶参与DNA单链裂口(gap)或缺口(nick)的修复，连接DNA分子的自由末端

1970年Wisconsin大学H.G.Khorana实验室发现T4DNA连接酶活性更高，能催化完全分离的两段DNA分子进行平末端的连接▼载体

早期载体工作的研究对象：噬菌体；侧重于研究病毒和寄主细菌间的关系1946年L.Berg研究细菌性因子(F因子),50-60年代相继发现抗药性R因子：分子量小，具有抗药性选择标记和易于操作等优点1973年S.Cohen将质粒作为基因工程载体使用20世纪40年代Avery发现外源DNA分子导入细菌细胞的转化现象(肺炎链球菌实验，发现DNA是遗传信息的携带者而非蛋白质)▼受体1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌的细胞经过氯化钙的适当处理后，便能够吸收λ噬菌体的DNA1972年以后，大肠杆菌成为分子克隆的良好受体20世纪70年代的上述发现，从技术层面上解决了用基因工程改良生物的实际问题，最终促成了基因工程学科的诞生第一个重组体的构建

1972年，美国斯坦福大学P.Berg等在PNAS上发表了题为∶“BiochemicalmethodeforinsertingnewgeneticinformationintoDNAofSimianVirus40:circularSV40DNAmoleculescotaininglamdaphagegenesandthegalactoseoperonofEscherichiacoli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA69:2904-2909,1972”，标志着基因工程技术的诞生2个重大历史事件1972年，美国斯坦福大学

P.Berg博士等用E.coRⅠ酶切猿猴病毒SV40DNA和λphageDNA后，用T4DNA连接酶将两种消化片段连接成重组体分子

意义：世界上第一次成功的DNA体外重组实验

P.Berg的贡献：

第一个有功能的重组体的构建◆虽然Berg的工作具有划时代的意义，但是他们并没有证明体外重组的DNA分子具有生物学功能◆1973年，S.N.Cohen等在PNAS上发表文章“ConstructionofBiologicallyFunctionalBacterialPlasmidInVitro”（S.N.Cohen,A.C.Y.Chang,H.W.Borer,andR.B.Helling,Proc.Natl.Acad.Sci.USA70:3240-3244,1973）宣布体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，完善了Berg开创的基因重组技术Cohen的贡献：

1973年,斯坦福大学

S.N.Cohen等将E.coli的R6-5质粒DNA：编码卡那霉素（kanamycin）抗性基因pSC101质粒：编码四环素（tetracycline）抗性基因

体外切割并连接成重组体分子，转化E.coli，筛选出了具双抗抗性的菌落,实现了细菌遗传性状的转移中国的胰岛素生产之路：1998年，中国成功研发出具有自主知识产权的基因重组人胰岛素。世界上三个能生产基因重组人胰岛素的国家：美国、丹麦和中国1982年，第一个基因工程药物在美国批准上市：基因重组人胰岛素

（通化东宝-甘舒霖：95年开始研发，98年成功，2008年规模生产，亚洲最大）徐州万邦？BoyerandCohen

-

研究策略基因和基因工程的概念

基因（gene）是遗传学家约翰（W.Johannsen）在1909年提出来的，他用基因这一名词来表示遗传的独立单位，相当于孟德尔在豌豆试验中提出的遗传因子孟德尔的遗传因子阶段；摩尔根的基因阶段；顺反子阶段；现代基因阶段（操纵子、移动、假、断裂、重叠基因）基因(gene)核酸分子中储存遗传信息的遗传单位，包括编码功能蛋白质或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列基因工程(geneticengineering)：“重组DNA技术”

将外源基因通过体外重组后，导入受体细胞，使该基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的现代生物技术目的：获得由外源基因所编码的蛋白质

改变受体生物的遗传性状,创造新的生命特点:分子水平操作，细胞水平表达基因工程实施的4个要素：

工具酶载体基因受体细胞载体目的基因构造DNA重组分子(载体+目的基因)转化/转染/转导(使重组DNA分子进入寄主细胞)表达(外源基因在寄主细胞内转录、表达)基因工程产品的分离纯化基因工程的操作流程或促使生物体遗传性状发生改变基因工程研究的主要内容基础研究：针对基因工程技术的操作流程应用研究：基因工程药物、转基因植物、转基因动物、酶制剂工业、食品工业、化学与能源工业及环境保护等。基因工程的安全性研究1、基因工程载体：核心环节；适于高等动植物基因的表达载体和定位整合载体有待大力开发；2、基因工程工具酶：DNA的体外合成、切割、修饰和连接等一系列过程中需要的酶；3、基因工程新技术：特殊用途的PCR技术、电泳技术、转化技术（如基因枪和电激仪）；4、基因工程受体系统：原核生物大肠杆菌、蓝细菌、酵母菌、高等植物的部分组织和器官、动物的生殖细胞或胚细胞-体细胞、人的体细胞-异