藻类生物学实验室新生培训手册

藻类光生物学试验室生培训手册2乐观参与，enjoyit！【培训内容】●了解试验室规章制度及争论生须知●把握根本试验技术●培训总结为了使试验室能够高效、有序的运转，藻类光生物学试验室制定了自己试验时，各位争论生还需要遵守争论生守则，以保证自己能够顺当毕业。培训时间：入学第一周第一天为了能够进展科学争论，一些根本试验技术的把握是必需的，生将在试验预习。培训时间：开学第一、二周海水二氧化碳系统各重量的计算：气态CO2溶入海水后，一方面听从亨利定律〔在肯定温度下，气体在液体中的饱和浓度与液面上该气体的平衡分压成正比〕CO2(g)←→CO2(aq)，因此CO2[CO2]与CO2的平衡分压pCO2之间的线性关系可表示为[CO2](aq)=KH*pCO2，KH是海水中二氧化碳的溶解度系数与温度、盐度和压力有关;另一方面，CO2还和水反响生成碳酸，CO2＋H2O←→H2CO3，然后，H2CO3分两步电离H2CO3←K1’→H+＋HCO3-－←K2’→CO32-＋2H+H+ 3 2 3a [HCO-]/[HCO] 〔1〕H+ 3 2 3H+ 3 3a [CO2-]/[HCO-] 〔2〕H+ 3 32K1’、K’、分别是碳酸的第1、第2表观解离常数,23其中[HCO3－]+2[CO2-]=Ac 〔3〕3Ac为碳酸盐总碱度,它跟海水总碱度(AT)有如下关系：Ac=AT-2.206×10-5×B Cl‰×KB’/〔K’+a B =AT–BCl‰是海水氯度，KB’是硼酸的解离常数K当海水温度、盐度确定时，、K’、K’、B值都可查表得到，这样通过测定KH 1 2海水的pH和总碱度，按以下方程即可计算碳酸盐体系各组分(HCO3-、CO32-、CO2*、∑CO2)的浓度和pCO2。由公式〔1〕〔2〕和〔3〕可得碳酸系统各组分计算公式：H+[HCO3-]=Ac/(1+2K2’/a )H+2 3 2 H+ 2 [CO2-]＝Ac×(K’/a )/(1+2K’/a )[CO2*]=(Ac×aH+/K1’)/(1+2K’/2 3 2 H+ 2 3∑CO2＝[HCO3－]+[CO－]+[CO2*]3H+ H+ 1 2 =Ac×[(1+K2’/a +a /K’)/(1+2K’/a pCO2=[CO2*]/KH+ H+ 1 2 2 2 3 CO(aq)和HCOCO*2 2 3 以上各参数计算在软件CO2SYS完成(BLewis,E.,andD.W.R.Wallace.ProgramDevelopedforCO2SystemCalculations.ORNL/CDIAC-105.CarbonDioxideInformationAnalysisCenter,OakRidgeNationalLaboratory,U.S.DepartmentofEnergy,OakRidge,Tennessee.)。5.989.10DIC组分的含量。细胞色素的定量叶绿素a〔chla、叶绿素c〔chlc〕和类胡萝卜素【试验原理】chla665nmchla的含量。【试验步骤】1〕将藻体置于肯定量的甲醇中，放置于4℃的冰箱内过夜处理。2〕1500g10min，750、665、652OD3Porra供给的公式,[Chla](μg/ml=16.29〔665－750－8.54〔652750，计算其含量。chlc含量：chlc(μg/ml)=67.3×A635-14.1×A668A668635668的吸取值。Strickland&Parsons的公式计算类胡萝卜素含量：Carotenoids(μg/ml)=7.6*[(A480－A750〕-1.49*(A510－A750藻红〔PE〕和藻蓝蛋白〔PC〕0.2g的藻体，在研钵内参加肯定量的石英砂和少量的磷酸缓冲液〔pH＝6.8〕将藻体研碎，10分钟，取上清液，将沉淀物连续研磨，并重复上面的步骤，564 最终将溶液定容为25ml，然后用分光光度计测定A455、A 、A 564 A618A645值。PEPC[PE]=[(A564-A592)-(A455-A592)*0.2]/0.12[PC]=[(A618-A645)-(A592-A645)*0.51]/0.151.藻体研磨要尽量充分，直至离心沉淀物根本无颜色。计算题：培育液中藻体的浓度是105cells/ml,取10ml培育液，离心，750、665、652OD0.001、0.0082、0.0026，求单位细胞藻体中叶绿素含量。问答题：1.为什么在测定叶绿素定量或扫描吸取光谱时，通常需要测定750nm的吸光值？色素定量的公式较多，承受不同计算公式，验证差异的大小。色素的提取，是定量的关键，如何确定提取是完全的？对于组织构造负责的藻体，需将其研磨碎后提取，应留意那些步骤？光合作用速率的测定C14测定方法【试验原理】〔初级生产力〕依照SteemanNielsen〔1952〕14C同位素标记法来进展测定。浮游植物进展光合作用需要固定海水中的无机碳〔DIC，海HCO3-、CO32-、CO2H2CO3等形式存在，它们之间存在动态平衡，可以相互转化，这样当参加H14CO3-时，经过培育之后，通过液闪计数可以计算浮游植物14CDICH14CO3-的比例，可以推算浮游植物总共固定了DIC。【试验步骤】进展光合固碳速率测定时，将取得的水样用180µm孔径的筛绢滤去浮游动物，20ml的石英管中。然后用连续加样器〔eppendorf〕吸取肯定体积的14C液体，按每管100µl〔放射活度为5µCi〕的加样量参加，盖上塞子摇匀后到室外承受阳光照耀〔或在太阳模拟器下。石英管盖上或包裹上不同的膜以承受不同的阳光辐射处理，膜的类型因试验目的的不同而不同，培育过程中用流水水浴控温〔当以模拟器为光源时，用空调控温24小时。GF/F直25mm20ml的液闪瓶中。最终将液闪瓶连同滤膜一起放入到一个密闭的塑料盒中，同时在盒中放一小其次天将液闪瓶取出放入45℃烘箱中烘干，储存。每个液闪瓶中参加闪耀液〔OptiphaseHisafe3〕3ml。放置2-3h后，置于液体闪耀计数仪〔ScintillationCounter,BeckmanCoulter,LS6500〕中测定。浮游植物固碳量用以下公式计算：μgC/L=[(CPM-CPM)/Ce]×I×DIC/AL D f〔每分钟计数的数目；CPMD为比照样品〔暗瓶〕中被固定的放射性物质的放射量；Ce14C的标准样品获得；CO214C12C的利用率存在差异，6%If1.06；DIC为培育液总溶解无机碳浓度；A14C的每分钟裂变数DPM〔14C活度06固碳速率(µgC(µgchla)-1h-1)由该固碳量除以叶绿素浓度及培育时间得到。NaH14CO3

在溶液中是一个平衡体系，所以样品尽量保存在低温下(4oC)以气体挥发，污染环境并影响测定结果。2操作空间通风良好，以尽量削减呼吸吸入造成内辐射。样品处理是关键，否则会影响试验结果，甚至看到的试验现象为假象。得到2-3够，一般酸化过夜)；野外试验时，酸化后样品一般要烘干(或-20oC)保存，烘烘干时间>6h。样品带回试验室测定时，参加闪耀液后最好放置2-3h后测定，以便使样品充分消化，然后再进展计数。〕C14的量与叶绿素浓度的关系〔参考数值：<0.1μgchla/L 0.1～5μgchla/L 加5μCi；>5μgchla/L 1μCi14〔AmershambioscienceUKLimiteNa14C3浓缩液12.5ml,总活度25mCi2mCi/ml50µCi/ml。具体操作为：先用一般滤纸预先过滤一定体积的海水，再用直径50mm孔径0.47µm的微孔滤膜反复过滤。为防止在接下来的8080%的海水将Na14CO34℃冰箱中备用。20ml5μCiC-146小时后，过滤、酸化、烘干、参加液闪计数，到得的数值是CPML9754.4，CPMD1034.8，液闪计数仪的计数0.960.32μg/L,DIC2.2mM，求海水中浮游植物的固碳速率(µgC(µgchla)-1h-1)。氧电极法〔CO2一样，见下〕化所需要的时间以及反响槽的容积可以计算光合作用速率。【留意事项】需要保持温度的恒定，并进展搅拌。30%，反响器中细胞浓度不能过高。P-Ccurve测定将细胞悬浮于无碳海水中后，取肯定体积量注入反响容器，在400μmolm-2s-1光强下，使细胞进展光合作用CO2”耗竭〔净放氧速率为零〕之后，添加NaHCO3溶液，在各种“CO2”浓度下测定藻类的光合作用速度。Michaelis-Menten方程拟合求得：V=Vm*[S]/(Km+[S])V：给定无机碳浓度下的净光合放氧速率[S]：DICCO2浓度一半时的无机碳〔DICCO2〕浓度留意事项放氧到达零所需的时间拉长。这种状况下，细胞在强光照和低CO2浓度下简洁2受损伤，导致光合作用活性降低;CO2浓度的适应性，影30min30min,CO2缓冲液和试验材料。2测定条件确实定CO2以外影响光合作用速度的主要因子有光照强度、光质、温度、溶CO2浓度关系之前.首先需要确定光合作用速度饱和时的光照强度，然后在此光照条件下确定其最适温30%(封闭系统测定时氧浓度增高、无机碳浓度降低等导致光合作用低下的现象)。(反响液)的配制CO2〔CO2-free〕缓冲液CO2浓度反响液时是必需的。测定海产藻类时用低浓度的盐酸将海N210-20min就行，水量多时可适当延长。将海水NaOH溶液(将过NaOHCO2的NaOH溶液)pHCO32-NaOH溶液中“CO2N2向蒸馏水充气，驱除CO2NaOHpH。由于调配好的缓冲液中还会有极少量的CO2溶入，所以最好用吸气器再进展脱气。25－50mmol/L的缓冲液(依据设定pH值的不同选择MES, HEPES, Bis-Tris-Propane, Tricine, 这些缓冲液均不被细胞吸取，所以对细胞的生理活性不产生影响。P-Icurve测定(0,50,100,300,600,900μmol·m-2·s-1)，光照强度用光量子计测定。P－I(Pmax)(Rd)从曲线中直接读出，P-I曲线的初始斜率(即光合作用在光限制局部的斜率)。光补偿点及光饱和点的计算公式为：Ic=-Rd/ɑ,Ik=(Pmax+Rd)/ɑ(Henley1993)。红外气体分析法开放系统法：用叶室开放气路系统法测定大型海藻在空气中的CO2吸取速率。测定时所承受的温度水平通过调整空调房中的温度而掌握(在上可以显示叶室中藻体的温度)。测定呼吸速率时使叶室处于黑暗之中。依据光)重)和气流量而计算光合(或呼吸)速率。其计算公式为：Pn=△C×F×60×273/[(273+T×22.4×DW]F(Lmi-1);T为光合反响温度C);DW为藻样干重〔。计算题：从海水中取一片藻体，吸干其外表水分称得其重量是0.7g，放入叶25oC，在肯定光强条件下，其恒定△C为40ppM，气体流速为0.2L/min,求该藻体的光合作用速率(μmoleC微藻常用培育法4.14.1(batchculture)在一个相对独立密闭的系统中，一次性投入培育基对微生物进展接种培育的方(batchculture)。由于它的培育系统的相对密闭性，故分批培育也叫密闭培育〔closedculture。分批培育特点：他任何掌握。4,对数期、稳定期及衰亡期。培育周期短，染菌和细胞突变的风险小。〔semi-continuousculture〕度恒定或培育液总体积不变。半连续培育特点：细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培育过程可连续到很长时间。可进展屡次收获。常用培育基的配置f/2Mediumf/2Medium(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL过滤海水中参加以下物质：QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLNaNO375g/LdH2O8.83x10-4M1mLNaH2PO4·H2O5g/LdH2O3.63x10-5M1mL*Na2SiO3·9H2O*30g/LdH2O*1.07x10-4M*1mLf/2tracemetal(seerecipebelow)-solution0.5mLf/2vitamin(seerecipebelow)-solution1L，高压灭菌。元素。f/2TraceMetalSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸馏水中参加以下物质:QuantityQuantityCompoundStockSolutionMolarConcentration3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M4.36gNa2EDTA·2H2O-1x10-5M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O4x10-8M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O3x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O8x10-8M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O5x10-8M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O9x10-7MinFinalMedium1L，高压灭菌。inFinalMediumf/2VitaminSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸馏水中参加以下物质：QuantityCompoundStockSolutionMolarConcentrationinFinalMedium1mLVitaminB121.0g/LdH2O1x10-10M10mLBiotin0.1g/LdH2O2x10-9M200mgThiamine·HCl-3x10-7M(cyanocobalamin)1L，4℃保存。(cyanocobalamin)留意：由于维生素B12和生物素是以结晶形式存在，因此在配制母液的时候，B120.89mLdH2O，1mg9.6mLdH2O。KMediumKMedium950mL过滤海水中参加以下物质：QuantityQuantityCompoundStockSolution1mL1mL1mL1mL*1mL1mL1mL0.5mLNaNO3NH4Clbeta-glycerophosphateNa2SiO3·9H2O*H2SeO3Tris-base(pH7.2)75g/LdH2O2.68g/LdH2O2.16g/LdH2O30g/LdH2O*1.29mg/LdH2O121.1g/LdH2OKtracemetalsolution (seerecipebelow)f/2vitaminsolution(seerecipebelow)MolarConcentrationinFinalMedium8.83x10-4M3.63x10-5M1x10-5M1.07x10-4M*1x10-8M1x10-3M--1L，高压灭菌。KTraceMetalSolution(Kelleretal.1987)900mL蒸馏水中参加以下物质:41.6gNa2EDTA·2H2O-1x10-4M3.15gFeCl3·6H2O-1x10-5M1mLNa2MoO4·2H2O6.3g/LdH2O1x10-8M1mLZnSO4·7H2O22.0g/LdH2O1x10-9M1mLCoCl2·6H2O10.0g/LdH2O1x10-9M1mLMnCl2·4H2O180.0g/LdH2O1x10-8M1mLCuSO4·5H2O9.8g/LdH2O1x10-8MQuantityCompoundStockQuantityCompoundStockSolution MolarConcentrationinFinalMediumf/2VitaminSolution(Guillard&Ryther1962,Guillard1975)950mL蒸馏水中参加以下物质：QuantityCompoundStockSolutionMolarFinalMedium1mLVitaminB121g/LdH2O1x10-10M10mLBiotin0.1g/LdH2O1x10-9M200mgThiamine·HCl-1x10-7M(cyanocobalamin)1L,过滤消毒到塑料瓶中，4℃保存。(cyanocobalamin)留意：由于维生素B12和生物素是以结晶形式存在，因此在配制母液的时候，dH2O，1mg9.6mLdH2O。三培训总结性意见。时间：开学其次周最终一天叶绿素荧光技术〔chlorophyllfluorescencedynamics〕技术被称为争论植物光合气体交换指标相比，叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”的特点。断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。〔低能态〕跃迁到激发态〔高能态〕。激发3〔光化学反响〕、发出荧光和以热的形式耗散掉。依据能量守恒定律，三者有如下关系：+光化学+热=1PSII的全部反响中心处于完全开放状态〔qp=1〕并且全部的非光化学过程处于最小时〔qn=0〕时的荧光产量。Fm：最大荧光，是在暗适应状态下当PSII〔qp=0〕并且全部的非光化学过程处于最小时〔qn=0〕时的荧光产量。Fm’在光适应状态下当PSII的全部反响中心处于关闭状态〔qp=0〕并且全部的非光化学过程处于最优时〔qn>0〕时的荧光产量。Fo’在光适应状态下当PSII的全部反响中心处于开放状态〔qp=1〕并且全部的非光化学过程处于最优时〔qn>0〕时的荧光产量。Fv/Fm是PSII的最大光化学量子产量，又叫原初光化学的最大产量、PSII光化学反响的潜在产量、PSIIPSII反响中心均处于开放状态时的量子产量。当藻类或植物受到胁迫时，Fv/Fm显著下降。因此，Fv/Fm是争论光抑制或各种环境胁迫对光合作用影响的重要指标。Fv‘/Fm’是PSII光化学的有效量子产量，代表激发能被开放的反响中心捕获的PSII的光化学被限制的程度。由Fv’/FmFv/Fm灭系数q〔0≤q≤1〕来表示。叶绿素荧光淬灭一般分为光化学淬灭〔qn〕和非〔qnNPQ〕Xe-PAM操作步骤：在电脑上双击Wincont软件进入操作界面；将样品参加样品池，放入样品槽，依据 Ft值〔300-500〕设置取出样品池〔或样品池中参加参比液，如培育基滤液等〕点击Auto-zero，试验过程中无论改动什么参数，测量前都需自动调零，依据需要在设置窗内设置相应参数〔可以保存以便下次使用；3.暗适应样品要想获得Fv/Fm，需要点击界面右侧参数区Fm按钮，然后点击SAT-Pulse按钮获得相应Yield值；4.同样在Lightcurve，Inducedcurve界面获得相应曲线。GFS-3000F操作步骤：使用前需对分析器进展校准：需联机对仪器进展校准，参阅说明书。当|dCO2|>2ppm时需对CO2进展校对零点；当|dH2O|>200ppm时需对H2O进展零1-23-5个月进展CO2和H2Ospan〔最大值〕连接仪器。连接叶室和主机，连接时留意From和To管的连接。连接进气管和电源。on〕，然后选择标准测量头〔Standardhead〕或荧光附件〔LED-Arry/PAM-Module3055-FL〕。在测量模式〔Measuremode〕下预热30～60分钟。在菜单设置下进展文件名和参数的设定。首先设定文件名〔Filename〕。然低一些，标准设定为750。设定流速之后，可设定CO2和H2O的浓度。假设利用环境大气，不需掌握CO2浓度，则不必设定，而且须将CO2吸取管换为空管；掌握CO2浓度需先将CO2吸取管换上，同时安装好CO2注入系统〔小钢瓶〕；取消CO2设定操作：选择CO2，选OFF即可，未设定前显示未CO2off。设定叶室风扇5〔Light通常选择PARtop，然后按light设定光强。选择叶室温度掌握模式(Tempmode)：>>翻页,设定荧光参数，夹上无荧光的薄片进展调零Z－offset;夹上暗适应后的叶片后调整测量光强度ML－Ampl及Gain使得瞬时荧光值Ft在200－300之间；其它参数为默认设定值即可。不测定初始荧光Fo和Fm时无需设定。将叶室关闭严实，观测主机前面的样品室和参比室的气流指示器显示的流量校准气流直至流量相等〔参考〕。按窗口下部的测量模式ModeMP即选为调零模式ModeZP，在此模式下进展调零，约30min，选Windows中的2charts，查看查看dCO2ZP和dH2OZP确实定值是否稳定〔均应接近直线〕并趋近于零，调零确保测得的数据准确〕按ModeZP选ModeMP，进入测量模式，开头测定光合；在ModeMP状态下，在Windows中选settings，下部常用的几个操作选择中将消灭储存叶室调零storeZPcuv。测定前需先选择storeZPcuv进展叶室调零〔注：尤其是测定的气此时在不加叶片时，窗口显示的光合值A/气孔导度GH2O应接近0。设定样品编号Object，将叶片夹入叶室中。假设叶面积可布满8cm叶室则不需积并依据公式进展计算。待各参数如净光合A，气孔导度GH2O等相对稳定时就可以按开头储存Startstoring间间隔Interval选择。同时测定荧光参数时可按窗口下方的常用操作中的储存测量值及最大荧光效率StoreMP+Fv/Fm(需先暗适应并保持叶室黑暗)，储存测量值和量子产额storeMP+Yield.参比室相平。USB〔System〕下选择文件传输Filetransfer,然后选择从GFS3000中输出文件transferfilesfromGFS300，之后依据提示操作即可将数据导入到电脑中。通过操作菜单1〔option1〕下的数据治理子菜单〔data-management〕可以删除储存卡中的数据文件.ZealquestWALZZealquestWALZ气体交换概述可控的参数:光强PAR(0-2023umol/m2/s)温度水汽含量(0-100%rH)(0-3000ppm)流速(0-1500umol/s)通风速度6HO+6CO22LightCHO+6O61262可计算的参数:蒸腾速率光响应曲线气孔导度胞间CO2浓度植物水分利用效率RH~100%,WiCiTemp.RH100%,WaCa(380ppm)COHO22VentilationFlow叶片在测量叶室内