样品分析方法

5.1样品前处理目的：将固体样品制成溶液；将待测组分提取或游离出来；排除干扰等。选择样品处理方法的一般原则：（1）样品的种类（2）被测药物的性质（3）测定方法专属性、分离能力、对不纯样品污染的耐受程度等。溶剂萃取法

有机破坏法5.1.1溶剂萃取法分离浓缩方法提高分析的专属性和灵敏度在中药材及其制剂的分析中应用较多方法：将疏水性的有机溶剂与样品水溶液充分混合，药物即在水相和有机相间进行分配，选择合适的有机溶剂和萃取条件，则大多数药物会从水相转移至有机溶剂中。1、有机溶剂的选择（1）与水不相混溶，与水的互溶性尽可能小（2）对待测组分有较好的溶解性能（3）沸点适中，最好低于水的沸点（4）毒性小乙醚可混入1-2%的水分2、pH值药物以非电离形式存在，易为有机溶剂提取。酸性药物：pH要低于pka值1~2个pH个单位碱性药物：pH要高于pkb值1~2个pH值单位中性药物：离子性药物：离子对提取法离子对试剂：烷基磺酸盐、烷基季铵盐采用缓冲溶液，维持提取效率的重现性。3、提取操作

提取容器：分液漏斗、萃取试管萃取试管：有标准磨口玻璃塞的离心管有机溶剂的用量：根据被测药物的溶解度和后一步使用的分析测定方法考虑。有机溶剂：水相（体积比）=1:1或1:2

操作：将样品、缓冲溶液和萃取溶剂置试管内，将试管放在旋涡混合器上旋涡混合进行液-液萃取。将试管置离心机内离心，使有机相和水相完全分离若需要下层液体，可将毛细吸管尖端伸入上液层，或通过玻璃水泵将上层液体吸走。（三）有机破坏法有机金属药物：金属原子直接与碳原子等共价结合含卤素、S、P等非金属元素的有机药物1、干法破坏瓷坩锅或铂坩锅碳酸钠或氧化镁等助灰化2、湿法破坏凯氏烧瓶无机混合强酸或强酸-强酸盐3、氧瓶燃烧法氧瓶燃烧法：将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧使其分解，然后将燃烧产物用吸收液吸收，采用适宜的分析方法进行分析。特点：简便、快速、破坏完全，尤其适用于微量样品的分析。吸收液：水或氢氧化钠水溶液。每种元素的吸收液在中国药典中有详细规定。薛立格（Schoniger）于1955年在国际微量化学会议操作方法将称取的供试品置于无灰滤纸中心，折叠后，固定于铂丝下端的弯曲处，使尾部露出;燃烧瓶内加入一定量的吸收液，并将瓶颈用水湿润，急速通入氧气1～2分钟，用表面皿覆盖瓶口，移至有防护设备的橱内，点燃包有供试品的滤纸的尾部，迅速放入燃烧瓶中，按紧瓶塞;待燃烧完毕后，充分振摇，使生成的烟雾完全吸入吸收液中，进行测定。5.2.1鉴别试验的目的根据药物的分子结构和理化性质，采用化学、物理化学或生物学方法来判断其真伪。鉴别试验用方法仅用于证实贮藏在有标签容器中的药物是否为其所标示的药物，而非对未知物的鉴别。采用一组试验项目，全面评价一个药物，每个药品一般2～3条。性状项和物理常数确认鉴别试验项目原料药鉴别制剂鉴别鉴别项下规定的试验5.2.21、性状

反映药物特有的物理性质。外观：指药物的聚集状态、晶型、色泽以及臭、味等性质。如二巯基丁二钠的描述为“本品为白色至微黄色的粉末；有类似蒜的特臭”。溶解度：一定程度上反映了药品的纯度。药品在不同溶剂中的溶解性能用“极易溶解、易溶、溶解、略溶、微溶、极微溶解、几乎不溶或不溶”来描述。物理常数：用于药品鉴别，反映其纯杂程度。药典收载的物理常数包括：相对密度、馏程、熔点、凝点、比旋度、折光率、黏度、酸值、皂化值、羟值、碘值、吸收系数。物理常数：比旋度：在一定波长与温度下，偏振光透过长1dm且每1ml中含有旋光性物质1g的溶液时测得的旋光度。吸收系数：通常在同品种制剂的含量测定、溶出度检查和含量均匀度测定时如果采用吸收系数法测定时，收载原料的吸收系数。这两种物理常数可用以区别药品、检查纯度或测定制剂的含量。

某一类药物组成中的阴离子和阳离子的特殊反应或典型的有机官能团反应。

中国药典附录收载一般鉴别试验（附录20）：丙二酰脲类、托烷生物碱类、芳香第一胺类、有机氟化物类、无机金属盐类、有机酸盐、无机酸盐2、一般鉴别试验3、专属鉴别试验药物分子中的特殊基团或官能团特殊反应或典型的有机官能团反应。如四氮唑法:C17位上有α-醇酮基的皮质激素。5.2.3鉴别方法与原理（一）化学法1、呈色反应2、沉淀反应3、气体生成反应4、焰色反应（二）光谱法1、紫外光谱法2、红外光谱法3、荧光法（三）色谱法TLC、HPLC、GC（四）生物学法（一）化学法1、呈色反应常用反应类型：（1）酚羟基的三氯化铁呈色反应（2）羧酸衍生物的异羟肟酸铁反应（3）脂肪氨基的茚三酮呈色反应（4）芳伯氨基的重氮化-偶合呈色反应

Ar-NH2+HNO2Ar-N2Cl Ar-N2-Ar’

HCl 1-萘胺低温 β-萘酚RCOOR’+NH2OHRCO-NHOH（异羟肟酸）OH-FeCl3红色配合物H+2、沉淀反应（1）游离沉淀反应例：青霉素钾（钠）青霉素(白色↓)（2）与重金属离子生成沉淀重金属离子的概念：在pH3.5的酸度条件下能与S2-离子形成不同颜色的沉淀的金属离子，如：铅、汞、银、铜、镉、锡、锑、铋等。（3）生物碱及氮杂环类药物的沉淀反应生物碱试剂：重金属盐类、大分子酸类重金属盐类：KBiI4、K2HgI4、I2-KI、HgCl2等；大分子酸类：硅钨酸、磷钼酸、苦味酸、鞣酸、磺基水杨酸等。注意：并非生物碱专效试剂稀HCl3、气体生成反应（1）生成氨（或胺）气胺（铵）类、酰脲类、酰胺类在碱性介质中游离出胺，加热有胺的特殊气味。如：抗癫痫药扑米酮，环酰亚胺的结构，药典（2010版）二部：取本品0.1g，加无水碳酸钠0.1g混合后，加热灼烧，即有氨气产生，能使湿润的红色石蕊试纸变为蓝色。（2）生成有刺激性特臭的SO2、H2S等含硫药物，在强酸性条件下加热产生（3）生成乙酸或乙酸乙酯乙酸酯或乙酸胺类药物如阿司匹林，中国药典（2010年版），【鉴别】（2）取本品约0.5g，加碳酸钠试液10ml，煮沸2分钟后，放冷，加过量的稀硫酸，即析出白色沉淀，并发生醋酸的臭气。（4）产生紫色的碘蒸汽含碘的药物，在一定条件下加热产生。泛影酸，中国药典（2010年版），【鉴别】（1）取本品约10mg，置坩埚中小火加热，即产生紫色的碘蒸气。4、焰色反应用盐酸湿润的铂丝蘸取供试品后在无色火焰中燃烧，使火焰呈现某种元素特异颜色的反应。（二）光谱法1、紫外光谱法共轭结构光谱特征参数：对比吸收光谱特征参数比较吸收度比值一致性对比吸收光谱一致性注意：电子光谱，特征性不是很强只适用于纯物质的鉴别2、红外光谱法特点：分子的振动-转动光谱，特征性强，是一种专属性极强的鉴别手段。特别适合于化学结构比较复杂或结构差异较小的药品鉴别。方法：对比供试品红外吸收光谱与药品标准红外光谱的一致性，尤其是指纹一致性。例：醋酸氢化可的松、氢化可的松标准图谱对照法《中国药典药品红外光谱集》USP对照品比较法注意：只适用于纯物质的鉴别3、荧光法特点：专属性很强方法：直接、间接例：维生素B1的鉴别——硫色素反应维生素B1加酸荧光消失，加碱荧光又出现。加酸荧光消失，加碱荧光又出现（三）色谱法TLC、HPLC、GC对照品比较法保留值优点：对复杂样品具有分离能力，是各类鉴别试验方法中专属性较强的方法之一。注意：若某药品标准已在有关物质检查或含量测定项下采用了HPLC法，则可同时采用HPLC法进行鉴别。有时需同时制备阴性对照品，即不含待检药材或成分的供试品。避免共存组分引起的假阳性。

四）生物学法利用微生物或动物进行鉴别试验的方法一般多用于抗生素及生化药物优点：专属、灵敏缺点：操作烦琐、耗时较长。例：青霉素，从2005版开始该项鉴别试验已被简便快速的且同样专属性强的HPLC鉴别法代替。鉴别常用方法化学反应、UV、IR、色谱法收载原则：专属性强、重现性好、灵敏度高，操作简便、快速，符合环保要求。原料药：3-5个鉴别项目，一般IR必不可少，兼顾功能团的化学鉴别和光谱及色谱鉴别。例：三唑仑26、阿苯达唑393化学药物制剂：1-3个鉴别项目，功能团的化学鉴别和光谱及色谱鉴别。例:阿司匹林片385中药及其制剂：一般TLC必不可少,凡有原粉入药者应做显微鉴别，兼顾理化方法.例：人工牛黄5、金银花205、六味地黄丸5975.2.4鉴别试验的灵敏度1、表示方法检测限：最低检出量（μg）、最低检出浓度2、空白试验blanktest一般：特殊：供试品也加，不加某一试剂。3、提高反应灵敏度的方法（1）浓集产物（2）改进观测方法5.3杂质检查

对生产或储存过程中可能产生或掺入的杂质进行检查，以判断样品的纯度是否符合要求。又称纯度检查。1、杂质的概念（1）有毒副作用的物质。（2）本身无毒副作用，但影响药物的稳定性和疗效。（3）本身无毒副作用，也不影响药物的稳定性和疗效，但影响药物的科学管理的物质5.3.2杂质的来源1、生产过程中引入（1）由起始原料引入（2）由合成或提取分离过程引入（3）由制剂过程产生例：盐酸普鲁卡因注射液（对氨基苯甲酸酯）对氨基苯甲酸（4）由生产装置引入2、贮藏过程中产生水解、氧化、分解、异构化、晶形转变、聚合、潮解和发霉等。易发生水解反应的结构：酯、内酯、酰胺、卤代烃、苷类等在酸碱或高温下水解反应更容易发生如：阿司匹林原料药和各种制剂均要求检查游离水杨酸易发生氧化反应的结构：酚羟基、巯基、亚硝基、醛、长链共轭双键等如：地蒽酚（黄）→二羟基蒽醌（棕）ChP：紫外光谱法5.3.4杂质的限量检查方法1、杂质限量在不影响药物疗效和保证用药安全的前提下，药物中允许杂质存在的最大量，通常用百分之几或百万分之几（ppm）来表示。氯化物、硫酸盐：0.002%~0.01%重金属：10ppm砷盐：1ppm

杂质限量的制定原则：（1）杂质本身的性质（2）生产的可行性及分析检测能力2、杂质的限量检查限量检查：检查所含杂质是否超过杂质限量的规定，通常不要求测定其准确含量。(1)对照法注意：平行原则特点：需要对照品(杂质、主成分自身对照)(2)灵敏度法在供试品溶液中加入试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现。特点：不需杂质对照品例如：氯化钠中钙盐和钡盐的检查1011(3)测定法测定吸收度、pH值等。特点：不需对照品例如：肾上腺素中酮体的检查4593、杂质限量的计算肾上腺素中酮体的检查：取本品，加盐酸溶液（9→2000）制成每1ml中含2.0mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录IVA），在310nm的波长处测定，吸光度不得过0.05已知酮体的吸收系数=453，求酮体的限量？97：71．检查某药物中的砷盐，取标准砷溶液2ml（每1ml相当于1g的As）制备标准砷斑，砷盐限量为0.0001％，应取供试品的量为A.0.20gB.2.0gC.0.020gD.1.0gE.0.10g已知:c＝1g/ml＝1×106g/ml，V＝2ml,L＝0.0001%96：79．检查维生素C中的重金属时，若取样量为1.0g，要求含重金属不得过百万分之十，问应吸取标准铅溶液（每1ml＝0.01mg的Pb）多少ml？A.0.2mlB.0.4mlC．2mlD.1mlE.20ml5.3.5一般杂质检查1、检查项目⑴氯化物检查法 ⑵硫酸盐检查法⑶铁盐检查法 ⑷重金属检查法⑸砷盐检查法 ⑹炽灼残渣检查法⑺溶液颜色检查法 ⑻易炭化物检查法⑼澄清度检查法 ⑽干燥失重测定法⑾有机溶剂残留量测定法2、注意事项《药品检验操作标准》规定：（1）遵循平行操作原则①仪器的配对性如纳氏比色管应配对，刻度线高低相差不超过2mm②对照品与供试品的同步操作（2）正确的比色、比浊方法（3）溶液如不澄清，应滤过。（4）若供试品有色，需经消色处理后方可检查。外消色法如高锰酸钾中氯化物的检查，可先加乙醇适量，使其还原褪色后再依法检查。内消色法5.3.6特殊杂质检查

（一）物理法嗅、味、挥发性、颜色、溶解性及旋光性等的差异。例：硫酸阿托品(消旋体)莨菪碱(左旋体)-0.4°（二）化学法1、酸碱性差异例：苯巴比妥巴比妥酸甲基橙2、氧化还原性差异例：氯化钠中的碘化物淀粉混合液葡萄糖酸亚铁中高铁盐的检查滴定法3、呈色反应杂质特有的呈色反应例：阿司匹林中检查游离水杨酸4、沉淀反应例：甘露醇、枸橼酸钾等药物中的草酸盐5、杂质与一定试剂产生气体例：微量硫化物的检查醋酸铅试纸三）光谱法1、紫外-可见分光光度法与比色法的区别2、荧光法3、红外光谱法主要用于药物中无效或低效晶型的检查（四）色谱法TLC、HPLC、GC（1）杂质对照品比较法（2）自身对照法未知杂质或无杂质对照品5.4含量测定方法选择原则：根据被测组分含量高低、共存组分的干扰情况1、化学原料药侧重方法的准确性首选容量分析法2、化学药物制剂紫外分光光度法、HPLC、容量分析法3、中药材及其成方制剂侧重方法的专属性和灵敏度HPLC、GC1、含量测定原料药的含量测定：首选非水酸量法，准确度高。苯溴马隆制剂的含量测定：若赋形剂不干扰：紫外分光光度法。赋形剂干扰：高效液相色谱法或比色法（三氯化铁显色后的可见分光光度法）。2、鉴别原料药的鉴别：三氯化铁显色制剂的鉴别：薄层色谱法3、杂质检查薄层色谱法，高效液相色谱法5.5分析方法验证验证项目一、准确度二、精密度三、专属性四、检测限五、定量限六、线性七、范围八、耐用性九、系统适用性试验

一、准确度1、概念分析方法的测定结果与真实值或参考值的接近程度凡是定量测定的项目一般都要考察准确度。2、准确度的考察和表示方法至少用9个测定结果进行评价，报告已知加入量的回收率（%）或与标准方法的测定结果对比。原料药的含量测定2制剂的含量测定3杂质的定量测定23、对回收率的要求98％～102％如高效液相色谱法、气相色谱法和紫外分光光度法等。注意：同时精密度要符合要求二、精密度1、概念在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。平行测定2、表示用至少9次测定结果进行评价，或取测定浓度的供试液，用至少测定6次的结果进行评价。报告标准偏差SD或相对标准偏差RSD。3、精密度考察的三个层次（1）重复性在相同条件下，由同一分析人员测定所得结果的精密度。（2）中间精密度在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。考察随机变动因素对精密度的影响。（3）重现性在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。法定标准采用的分析方法，应进行重现性试验。4、对精密度数值的具体要求（1）滴定分析和重量分析，RSD<0.5％；（2）可见-紫外分光光度法和原子吸收分光光度法，RSD<1.5％；（3）高效液相色谱法和气相色谱法RSD<2％，薄层色谱法RSD<4％。（4）体内药物分析，大多数报道的色谱方法的RSD为5％～10％，（5）放射免疫测定(RIA)法,RSD可以适当放宽至20％～25％。三、专属性1、概念在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的方法能够正确测定出被测物的特性。各种分析方法都应考察专属性2、色谱法专属性的考察分离度应符合要求；给出代表性图谱，标注诸成分的位置，以证实其专属性；必要时进行色谱峰纯度检查，以证明被分析物色谱峰中不包含其他成分。采用二极管阵列检测器或质谱检测四、检测限1、概念供试品中被分析物能被检测出来的最低量。注意：不一定要准确定量。考察方法是否具备灵敏的检测能力。鉴别试验和杂质的检查方法，均应通过测试确定方法的检测限。2、考察方法（1）非仪器分析目视法（2）信噪比法适用于能显示基线噪声的仪器分析方法，如HPLC.一般以信噪比(S/N)为3/1或2/1时相应的被分析物的量确定检测限，应附测试图谱，并说明测试过程五、定量限1、概念供试品中被分析物能够被定量测定的最低量。注意：应具有一定的准确