第5章 目的基因制取

第五章目的基因制取在已知基因部分核苷酸序列或全部核苷酸序列的情况下，基因的制备方法主要可分为两大类：

化学合成法生物制备法基因文库法、

cDNA文库法

PCR法等。

就化学本质而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子结构，就可以进行基因的化学合成。有关DNA的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及固相亚磷酸酰胺法。磷酸二酯法是最初发明的化学合成基因的方法，而固相亚磷酸酰胺法是目前绝大部分DNA自动合成仪所使用的方法。由于现代科学技术的发展，DNA的化学合成已经广泛采用DNA自动合成仪进行。1.化学合成法

基因的化学合成法主要用于PCR扩增引物、核酸测序引物、核酸杂交探针和合成人工接头等核苷酸片段的合成,随着合成生物学的发展，近来也用于全基因合成。1.1磷酸二酯法将二个分别在5′-或3′-末端带有适当保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸将脱氧二核苷酸5′-或3′-末端脱保护，与另一个3′-或5′-末端脱保护的脱氧二核苷酸进行第二次缩合依次进行循环，直至合成全长的DNA分子A1.2固相亚磷酰胺法原理：将所要合成的寡聚核苷酸链的3′-末端先与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠（CPG）连接，然后依次从3′-5′的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，具体的合成和延伸过程：脱去CPG载体上第一个核苷酸的5‘端保护基（DMTrO)第二个核苷酸5‘端被DMTrO保护，3’端被亚磷酰胺保护，随后3‘端被四氮唑活化剂活化，和第一个核苷酸发生缩合，脱去四唑基团。没有参与缩合反应的第一个核苷酸的5’端被乙酰化封闭脱氧核苷酸二聚体的3价磷被碘氧化成5价磷，形成稳定的二聚体。二聚体5’端脱DMTrO，加入第三个被活化的核苷酸，进行循环。便于自动化操作，通过计算机控制进行基因合成DMTrO:二甲氧基三苯甲基三氯乙酸亚磷酸三酯磷酸三酯循环合成结束后脱去P上连的保护基团，并与固相载体脱离，进一步纯化化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150～200bp，而绝大多基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。

方法1是先将寡聚核苷酸激活，带上必要的5’-磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用T4DNA连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。

方法2是将两条具有互补3’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链DNA作为模板在大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链DNA片段，可经处理插入适当的载体上。

其它方法：多片段重叠延伸PCR

序列已知；化学合成的寡核苷酸片段长度有限，经基因组装才能合成较大的目的基因，而这往往使基因制备难度加大；化学基因合成比较昂贵。（约3元/bp)

1.3基因芯片法成本可降到0.01美元/bp限制化学法合成基因的因素：、DNAArrayManufacturingProcessVeryLarge-ScaleImmobilizedPolymerSynthesis(VLSIPS)TreatsubstratewithchemicallyprotectedlinkermoleculesSelectivelyexposearraysitestolightFlushchip’ssurfacewithsolutionofprotectedA,C,G,TRepeatlasttwostepsuntildesiredprobesaresynthesized照相平板印刷技术ProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGAMask1AAAAAProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGCMask2CCCCCCAAAAAProbeSynthesisarrayprobesA3×3arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotideDepositionSequenceACGGMask3CCCCCCAAAAAGGGGGG2.基因组文库法基因组文库法是一种直接从基因组中分离目的基因的方法。基因组文库（genelibrary或genebank），是指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体。高等真核生物染色体基因组文库通常是以λ噬菌体作为载体构建的，有时也可以柯斯质粒作为载体构建。通常基因组DNA被超声波或内切酶处理成随机处理成大小不同的片段，这些片段和载体连接后制备成基因组文库，用于测序、拼装。也称为“鸟枪法”。2.1基因文库的大小一个基因组文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目：N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f:插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因组DNA的百分数,其倒数为最低克隆数N：所需的重组载体数（克隆数）,一般为最低克隆数的5~10倍影响因素：基因组规模、载体容量★利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：①选用识别序列均为4个核苷酸的两种限制性内切核酸酶，对从某一高等真核生物组织细胞中提取的染色体基因组DNA

进行部分酶解，得到10~30kb的DNA限制性片段，利用凝胶电泳法等从中分离出大小为20kb左右的随机片段群体②选用适当的限制性内切核酸酶酶解λ噬菌体载体DNA。③经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。2.2基因组文库构建过程★具备了文库，就可以适当的目的基因片段作探针，利用高密度的噬菌斑或菌落原位杂交技术，从大量的噬菌斑或菌落中筛选出含有目的基因的重组体的噬菌斑或菌落，再经过扩增提取其中的重组体，最后即可获得所需要的目的基因片段。对于某些营养物质的合成基因的分离，可以将文库转化该营养的缺陷型菌株，在基本培养基中进行筛选。高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。3cDNA文库法cDNA文库:是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。N=ln(1-p)ln(1-1/n)一个cDNA文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目：1/n：每种低丰度mRNA分子占总mRNA分子的比值低丰度：不多于14个拷贝/细胞，对于真核细胞，占总mRNA质量的30%，约11000种。则1/n=30%（1/11000)，n为最低克隆数3.1cDNA文库的大小3.2cDNA基因文库的构建过程总RNA（totalRNA）提取mRNA分离纯化逆转录克隆筛选★①总RNA提取：胍盐-氯化铯密度梯度离心法酸性胍-酚氯仿抽提法

Trizol法（异硫氰酸胍+苯酚）

Trizol处理、氯仿抽提、收集水相、异丙醇沉淀异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的变性解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。（也破坏RNase）酸性苯酚可促使RNA进入水相氯仿可抽提酸性的苯酚，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

硅胶膜特异性吸附的离心柱提取法采用一系列裂解液裂解组织、细胞，抑制RNA酶，释放RNA，调节结合条件之后，硅胶膜特异性吸附RNA，多次漂洗去除DNA、蛋白质及其他杂质，最后经低盐溶液洗脱RNA

在高盐（如3-5M盐酸胍）低PH值（5.0-6.5）状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；而在低盐（TE或者2.5mMTris-HCL）或水溶液状态下，DNA被洗脱下来注意事项：

RNase酶在环境中普遍存在，要严格防止污染：全程需戴手套操作玻璃器皿200℃处理2小时以上不耐高温物品（枪头、离心管等）用DEPC（0.1%焦碳酸二乙酯）浸泡处理，然后冲净或煮沸去除DEPC。（包括试剂）破碎细胞需使用强变性剂：胍、酚等★RNA流经利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。②

mRNA的分离纯化纤维素柱层析法原理：当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上，然后逐渐降低盐浓度洗脱，在低盐溶液或蒸馏水中，mRNA被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上★原核细胞mRNA分纯

polyA加尾，酿酒酵母的polyA多聚酶可以特异性的对mRNA加尾，而对sRNA无法加尾逆转录23/16sRNA,加入RNase，DNaseI处理杂交链，23/16sRNA及DNA均被破坏，过柱富集mRNA分子磁珠法原理：

生物素标记OligoT，亲和素标记磁珠（生物素和亲和素间具有高度亲和力）。实验时生物素标记的OligoT与mRNA的polyA高效杂交形成复合体，此复合体又与标有亲和素的磁珠结合。用磁性分离架就可以将这堆复合物分离出来。最后用无RNase去离子水将mRNA从复合物中洗脱下来即☆③逆转录自身引导法（S1核酸酶降解法）

置换合成法（RNaseH处理）cDNA第一链cDNA第二链5’3’mRNAcDNA第一链3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’5’DNAligase去引物★AMV:鸟类成髓细胞白血病病毒的逆转录酶MLV:莫洛尼鼠的白血病病毒的逆转录酶随机引物法

6聚核苷酸随机引物引发cDNA第二链合成末端转移法（同聚物引导法）利用末端转移酶在cDNA第一链3‘端加同聚核苷酸尾巴（如多聚G），以多聚C为引物合成第二链（在多聚C的5’端可以加入酶切位点，利于后续克隆操作）。克隆筛选方法：同基因组文库缺点：由于克隆过程经多步分离、纯化，低丰度cDNA可能损失，被克隆的几率很小（借助PCR解决，P177图）

mRNA容易被部分降解，很难得到全长cDNA.（合成全长cDNA)★3.3全长cDNA文库的构建及cDNA克隆（1）RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是基于PCR技术由已知的一段cDNA序列,通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法.又被称为锚定PCR(anchoredPCR)和单边PCR(onesidePCR)。

PCR全长序列★以oligo(dT)l7和一个35bp的接头(dT17-adaptor,锚定引物)为引物进行反转录，接头序列中稀有限制酶的酶切位点。这样就在未知cDNA的3’末端接上了一段特殊的接头序列。利用已知的部分cDNA序列设计基因特异引物GSP，它)与少量(-)cDNA退火并延伸，产生互补的第二链(+)cDNA。利用GSP和接头引物进行PCR循环即可扩增得到cDNA双链。扩增的特异性取决于特异引物与目标cDNA分子互补能力．而用接头引物来取代dT17一adaptor则可阻止长(dT)碱基引起的错配。可设计嵌套引物进行PCR扩增，以提高低丰度cDNA扩增的特异性（见P179图）GSP:genespecificprimerGSP★3’RACE设计了一个用于逆转录的基因特异引物GSP-RT，进行逆转录，合成（-）cDNA。用RNase降解RNA，然后用末端转移酶在（-）cDNA的3‘端加poly(A或C)尾再用锚定引物合成第二链(+)cDNA,接下来与3’RACE过程相同。用接头引物和位于延伸引物上游的基因特异性引物GSP进行PCR扩增。5’RACE★CIAP(牛小肠磷酸酶)除去5’磷酸，非全长mRNA的5‘端无法进行连接，而全长分子有5’-cap的保护TAP（烟草酸焦磷酸酶）去除5’-cap，加入锚定引物，在RNA连接酶作用下将其连在全长mRNA5‘端嵌套PCR进行5’RACE连接酶介导的RACE★通常的克隆方法是同时使用一个切点位于接头序列上的限制性内切酶和一个切点位于扩增区域内的内切酶。由于大多数非特异性扩增的cDNA产物不能被后一个限制性内切酶酶切，因而也就不会被克隆．从而增加了克隆的选择效率。也可在基因特异性引物的5’端掺人一个限制性内切酶的酶切位点的方法来克隆。最后，从两个有相互重叠序列的3’和5’RACE产物中获得全长cDNA。最后通过分析RACE产物的3’和5’端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。优点：无需提纯mRNA,可直接从总RNA中得到目的基因全长序列,无需做克隆文库，只需做5‘端目的产物和3’端目的产物的亚克隆缺点：5’端的编码区经常会由于反转录过程的不彻底而丢掉,特别是由于有大的转录物或者存在复杂的二级结构时连接反应通常效率很低,不能保证PCR的高成功率经常出现非特异性扩增产物★（2）载体引物法

RNA经CIAP,TAP,RNA连接酶处理连上5‘端锚定引物后，加入具有多聚T尾巴的载体引物（即整个载体作为衔接体）反转录后用5’端锚定引物合成第二链，直接酶切处理进行自连接，转化宿主细胞得到全长cDNA文库。P183图（3）固相支持物法高碘酸钠处理5’cap后，可以在5’cap接上生物素，因此全长mRNA全部有生物素标记逆转录后用RNaseI水解单链核酸（RNA-DNA杂交双链不被水解）用亲和素包裹的磁性珠作为固相支持物，结合杂交链，得到全长cDNA第一链

184图8.18☆☆(4).SMART技术SMART(SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript)，模板转换机制原理：逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5‘帽子时会在cDNA3‘末端加上几个C，在逆转录时加入3’末端带Oligo（dG）的SMART引物，它与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于只有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。★★capcapPolyCPolyG利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的TotalRNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。3.4差示文库和消减文库（1）mRNA差别显示mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。差别基因表达（differentialgeneexpress）是细胞分化的基础。mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。基本原理：提取总RNA进行反转录，引物为Oligo（dT12）MN，其中M称为锚定碱基，为A，C，G中的任意一种。N称为分类碱基，为A，C，G或T中的任意一种，共有12种MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类。在此基础上用随机引物和反转录引物对每一类cDNA进行PCR扩增，然后进行凝胶电泳分析，从而确定不同样品间基因在时间和空间上特异性的表达。★优点：简单、快速、可检测表达的所有基因(包括低丰度），需要的总RNA量少；同时检测基因的上、下调表达、展现所有差异、比较多种细胞类型；缺点：检测全部mRNA的PCR工作量很大；PAGE分离的cDNA大于500bp时会漏检，出现差别条带太多，假阳性率高达70%左右一般得到mRNA3‘端非翻译区序列不同条带有可能重合（2）差别杂交法与差示文库差别杂交：分别制备两种细胞群体的mRNA提取物，其中一个群体含有目的基因mRNA，另一个群体不含。分别反转录制备总mRNA的cDNA探针，两类探针分别与表达目的基因的细胞群体构建的cDNA克隆文库杂交，从而筛选到含有目的基因的克隆。缺点：由于差别杂交中所使用的杂交探针是mRNA反转录成的cDNA群体，真正能与目的基因核苷酸序列完全互补的探针仅占很低的比例，以至于那些低丰度的mRNA的cDNA克隆很难用此法检测出来。其次，差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，因此是十分耗费时间和金钱的工作。两套平行转移的滤膜之间，DNA的保有量往往是有差别的，这样所得的杂交信号的强度也就不会一致，需要重新进行点杂交，以作进一步的阳性鉴定工作。所以说重复性差是差别杂交筛选法的又一个缺点。★差别杂交法（3）消减杂交法消减杂交法：将A细胞总mRNA制备的cDNA与过量的B细胞的总mRNA杂交，经过羟基磷灰石柱层析可以分离纯化出未杂交的cDNA，合成第二链后用其构成cDNA文库，该文库含有只在A细胞中表达的cDNA克隆和一些低丰度mRNA的cDNA

克隆，称为消减文库。也可反过来得到B细胞中的特异表达基因。该方法是差别杂交法的改进。★T细胞B细胞用固相支持物法、SMART等方法制备全长cDNAcDNA长度可能不全cDNA丰度过低PCR扩增后构建文库（4）代表性差异显示（RAD)代表性差示分析(representialdisplayanalysis)

：充分发挥了PCR以指数形式扩增双链模板，而以线性形式扩增单链模板的特性，通过消减和富集，使得差异基因片段得到特异性扩增。将待测cDNA（Tester）和驱离cDNA（Driver）分别用同一种识别4碱基序列的限制性内切酶切割形成的平均长度为256bp的cDNA片段分别接上寡聚核苷酸接头（adaptor），并以接头为引物进行PCR扩增将接头切除，并只在Tester片断末端接上新接头，然后将Tester与大大过量的Driver混合杂交。Driver过量的目的是使Ｔ群体中特异性序列没有遗漏的可能；复性，补平末端，并以新接头为引物进行PCR扩增，形成的3种杂交体中只有自身退火形成的Tester/Tester两端均能和引物配对，产物呈指数递增。Tester/Driver杂交体只能是单引物扩增，产物为单链DNA分子，其数量呈线性递增。Driver/Driver杂交体由于分子两端没有与新引物配对区而无法进行扩增；用MungBeanNuclease去除单链DNA分子，差异双链cDNA便完成第一轮富集。重复第2、3轮富集。

（P193图）★优点：可重复性好；假阳性少；mRNA用量少、特异性高。缺点：Tester组低丰度的分子自身杂交的几率很低(混合体系中有10%的单链分子），所以被扩增的几率仍很低；酶切连接步骤太多，cDNA会损失很多，所以可能漏掉关键基因；得到的不是cDNA全长而是其酶切片段。

实验中使用过量DriverDNA目的是充分使TesterDNA中与DriverDNA序列相同的片段杂交，酶解去除，只有差异双链cDNA经PCR几轮循环得以有效富集。（5）抑制性消减杂交（SSH）1996年建立了在抑制PCR与消减杂交技术上的差异基因检测方法――抑制性消减（扣除）杂交（SSH，suppressionsubtractivehybridization）。该方法运用了杂交二级动力学原理：即丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交速度快于丰度低的单链cDNA，从而使原来在丰度上有差别的单链cDNA相对含量达到基本一致。而所谓抑制PCR，则是利用链内退火优先于链间退火，从而使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。★与RAD相同，酶切后得到Tester与Driver样本的cDNA片段，将Te