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文档简介
第六章凝胶过滤GelFiltration概述凝胶过滤又称分子筛或称体积排阻层析。根据溶质分子量的大小而分离的一种液相层析技术。其特点是:(1)填料是具有一定范围的筛孔尺寸的凝胶,被分离物按分子量的差异在流动相的推动下,大分子被凝胶的筛孔排阻而先流出层析柱,小分子在孔中扩散而后流出。(2)被分离物不与填料发生任何化学结合;降低了因不可逆结合而引起的蛋白质的损失和失活。(3)快速纯化生物大分子,并在第一洗脱峰中,杂质流于柱中。凝胶过滤的发展理论与技术的发展1951.Kosikowrky用淀粉柱子分离蛋白质中的氨基酸;1955.Lundyuist,Storgaras在淀粉柱上按组分的分子量大小分离,提出排阻层析的概念;1956.Puthven在淀粉柱上估计了分子量。载体材料的发展1959.Rovath,Flodin合成了葡聚糖(Sephadex)凝胶;1962.Hierten,Mosbach合成聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamidebiogels);1964.Hierten合成琼脂糖球形凝胶(Spheriealagarose)1976.Regnier合成甘油丙基多孔玻璃(Glycerlpropyl)内容提要第一节 凝胶的分类及其性质第二节 基本原理第三节操作第四节应用第一节凝胶的分类及其性质所用的填料或载体通称凝胶;凝胶过滤层析中的填料产品较多,为了分辨纯化效果及分离样品的活性保存,对填料(载体或介质)的选择、层析条件的确定是首要考虑因素。凝胶筛孔的尺寸大小、凝胶颗粒的大小、均匀性、机械强度及化学稳定性均是凝胶层析的基本性质。
凝胶层析中常用凝胶包括5个主要类型,即:葡聚糖凝胶(dextrangel商品名Sephadex)琼脂糖凝胶(商品名为Sepharosegel)聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,商品名为Bio—GelP)Sephacryl由琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶(商品名为Superdex)一、葡聚糖凝胶SephadexG-型性质:1.亲水性:在水中易膨胀;2.交联度的型号丰富适应各种分子量范围的分级分离;3.稳定性:对强酸、氧化剂敏感。4.吸附性:凝胶含少量的羧基基团能与碱性蛋白质的电荷基团发生吸附,在纯化及标准曲线制作时有影响;可用中性盐0.05MNaCl洗脱克服。
结构:右旋糖酐G型与交联剂3-氯-1,2-环氧丙烷以醚键交联而成。二、琼脂糖凝胶SepharoseSepharose6B,4B,2B;由D-半乳糖和3,6脱水的L-半乳糖合成的球形结构。其网状结构由糖链间的次级氢键起稳定作用。由琼脂糖的浓度控制网孔的疏密和大小。分离范围1×104-5×107。ScanningelectronmicrographofanagarosegelMagnificationx50,000Ref: AndersS.Medin,PhDThesis,UppsalaUniversity1995SepharoseCL(琼脂糖凝胶)Sepharose与2、3-二溴丙醇反应形成交联琼脂糖。(SepharoseCL)其化学、物理的稳定性提高;机械强度增强;适用pH范围更宽。分离范围1×104-5×107。Bio-Gel A 三、聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP
丙烯酰胺用甲撑双丙烯酰胺交联成球形的聚丙烯酰胺的亲水性干凝胶。特性:对酸、碱的稳定性较弱,强酸、强碱引起酰胺基脱水。工作的pH范围2-10,在有SDS、盐酸胍、尿素、20%乙醇溶液中可安全使用。分离蛋白质分子量范围800-1.5×105。根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同,可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示,从Bio-GelP-2至Bio-GelP-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度(按球蛋白和肽计算)。四、聚丙烯酰胺葡聚糖Sephacryl烷基葡聚糖与甲撑双丙烯酰胺共价交联成。其物理、化学性质稳定,工作的pH范围2-11;可用于蛋白质、核酸、多糖、蛋白聚糖的分离。分离范围1000-1×107。五、Superdex高交联度的琼脂糖与葡聚糖共价结合的分子筛。具有稳定的物理化学性质;广泛的pH工作范围;对SDS、尿素、盐酸胍等不敏感;并不影响分离效果。既具有琼脂糖凝胶的特性;又具有葡聚糖凝胶的特性,是Pharmacia公司推出的新一代凝胶产品,适合于精细层析分离。目前分辨率、选择性最高的凝胶过滤介质,流速快而反压低。Superdex30<10,000Superdex753000-70,000Superdex20010,000-600,000内容提要第一节 凝胶的分类及其性质第二节 基本原理第三节操作第四节应用第二节基本原理基质具有立体网状筛孔结构。依据交联度不同,孔径的大小按不同的型号区分,而对某一种基质其孔径一致;当分离物足够大而完全排阻,不进入凝胶,随着外水体积(Vo)洗脱流出;或完全不排阻,洗脱时在凝胶的筛孔中自由渗透、扩散;物质在凝胶柱层析中被排阻的范围在0~100%之间的为部分排阻或不完全排阻。床体积Vt、内水体积Vi、外水体积Vo
与分配系数Kav之间的关系任何一种分离物在凝胶层析柱中被排阻的范围在0~100%之间,用排阻系数Kav表示。Kav的大小依赖凝胶床体积Vt,外水体积Vo及分离物本身的洗脱体积Ve。见公式:Vt=Vo+Vi+Vg当Vt、Vo确定后,Ve是随着分离物的分子质量的变化而变化,分子量愈大,Kav值愈小;反之亦然。依据公式Kav值在0~1之间变化Kav=Ve-VoVt-VoVt与Vo是定值,Ve随被分离的分子量变化而变化。Ve-VoVi+VgVt=Vo+Vi+VgVg忽略时,Kav=Vt=Vo+Vi或Vt-Vo=ViVe-VoVi=KavVe=Vo;Kav=0.Ve=Vo+Vi=VtKav=1,
当0﹤Kav﹤1:Ve=Vo+Kav*Vi,表示内水体积只有一部分可被组分利用扩散,其Ve在Vo与Vo+Vi之间变化。Kav﹥1,凝胶有吸附作用,Ve﹥Vo+Vi。带入上式,有Kav可以有下列几种情况:(1)当Kav=O时,则Ve=Vo,即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质(全排阻),洗脱容积等于空隙容积(组分I)。(2)当Kav=1时,Ve=Vo+Vi,即小分子可完全渗入凝胶内部时,洗脱容积应为空隙容积与内容积之和(组分Ⅲ)。(3)当0<Kav<1时,Ve=Vo+Kav*Vi。表示内容积只有一部分可被组分利用,扩散渗入,Ve即在Vo与Vo+Vi之间变化(组分Ⅱ)。(4)有时Kav>1,表示凝胶对组分有吸附作用,此时Ve>Vo+Vi,例如一些芳香族化合物的洗脱容积远超出理论计算的最大值,这些化合物的Kav>1,如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸在SephadexG一25中的Kav值分别为1.2,1.4和2.2。
层析柱中各物质发生连续地排阻与扩散效应,结果是:大分子量物质首先出来,再依分子量大小次序随后洗脱出。因此,Kav值的差异影响分离效果,Kav值的差异性大,分离效果好,Kav值的差异性小,分离效果差。不同上样体积时洗脱体积的测定A:加样体积极小时,洗脱体积Ve从样品入柱开始-洗脱峰的最大处止。B:加样体积中量时,洗脱体积Ve从样品入柱1/2时-洗脱峰的最大处止。C:加样体积特大时,洗脱体积Ve从样品入柱开始-洗脱峰出现止。VeVeVe原理小节Kav=0Ve=Vo
完全排阻Kav=1Ve=Vt
完全不排阻Kav=0~1之间
部分排阻Kav﹥1Ve﹥Vt
吸附现象
用凝胶过滤层析,溶质和凝胶表面之间没有任何相互作用时,体积排阻层析才能严格按照分子量大小进行分离;特殊分离效果与分子的结构、形状密切相关。
例:SephadexG-50分离范围=1500~30000,表示小于1500时,Kav=1;大于或等于30000时,Kav=0;当M.W=20000时,方法:1)测量洗脱体积;2)经过计算得出Kav=0.67,故可以将上述三者分开。问M.W为5万和7万的蛋白质,可否分开?为什么?内容提要第一节 凝胶的分类及其性质第二节 基本原理第三节操作第四节应用第三节操作一、凝胶的选择与处理凝胶的选择;凝胶的处理;凝胶用量的计算型号选择粒度克=
Лrh膨胀度(床体积/克干重)21.漂去破、碎的凝胶;2.凝胶的充分溶胀,沸水浴或真空泵抽气。凝胶颗粒大小对分辨率的影响
分辨率:粗颗粒劣于细颗粒;更劣于超细颗粒。核苷酸在不同大小凝胶颗粒中的洗脱图谱
二、凝胶柱的制备柱子的选择;柱子的填装;柱子的鉴定平衡柱子直径与长度比例、流速与分辨率的关系加样量与洗脱峰及分辨率的关系三、加样与洗脱加样洗脱加样量的控制原则定性目的:依据检测器的灵敏度确定,紫外检测蛋白质,加样量为Vt的1%~5%。(凝胶过滤会将样品稀释2~3倍),须对样品进行适当的浓缩。制备与脱盐:在不影响分辨率时,尽量加大样品体积,可达床体积的20~30%;加样量根据分配系数Kav或洗脱体积Ve确定。ABVeAVeBA、B两洗脱物体积之差为分离体积Vs,Vs=VeA-VeB,当样品体积Vp≤Vs时,二者分开。所以Vs,Vp,便可分开。样品粘度与洗脱曲线、分辨率的关系洗脱与绘制洗脱曲线洗脱液的组成简单:主要是洗脱液能溶解被洗脱物并不使其变性或失活。一般选用单一的缓冲液,若无非特异性吸附,离子强度为0.05M的中性盐;或用蒸馏水洗脱。洗脱流速恒定:用操作压、恒流泵及限制阀进行调节;或用恒压瓶、调节层析柱的进口与出口的两液面高度,使水压恒定,均匀,利于Kav值稳定,提高分离效果。安全装柱的注意保证柱子不会脱水保持水压高度一致,柱压稳定装柱子的操作图示凝胶的处理凝胶的填装柱子型号的选择层析系统的接通与平衡柱子的检测与样品的加入四、凝胶柱的保养和凝胶的保存
交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,适宜于微生物的生长。因此染菌后的凝胶会改变层析特性,影响效果。(1)经常使用的凝胶以湿态保存为宜。湿态保存常用的抑菌剂有0.02%叠氮钠、0.002%洗必太、0.1mol/L氢氧化钠等。(2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。内容提要第一节 凝胶的分类及其性质第二节 基本原理第三节操作第四节应用第四节应用一、脱盐和浓缩二、分离生物大分子物质三、去热源物质四、测定蛋白质的分子量一、脱盐与浓缩利用盐类小分子物质可以在凝胶的筛孔中自由扩散,而大分子物质被排阻在其外的原理,选择凝胶SephadexG-25(700-8000)将小分子盐有效地除去。比透析方法更加温和,速度快,不引起生物大分子的变性。对盐析样品的后处理非常适用。凝胶具有吸水的性质,可将透析袋内的稀样品进行浓缩。蛋白质的脱盐和浓缩二、分离生物样品某些理化性质相近(溶解度、电荷性),分子量不同,或聚合体不等的混合样品,其他方法难以奏效时,凝胶过滤方法便适用。用加工修饰的凝胶纯化糖链分子、膜蛋白、抗原、抗体、分离重组蛋白,包涵体蛋白、肽类、核酸、病毒以及寡核苷酸等。分离病毒:
根据颗粒的大小将不同的病毒分别洗脱>30nm>20nm三、去除热源(内毒素)物质热源又称内毒素,是含脂肪A、糖类和蛋白,带负电荷的复合大分子。由于是制备药品工艺中难以克服的问题,经常引起临床的安全。可利用凝胶排阻原理,将热源物质从药品中排除。四、用凝胶过滤方法测定蛋白质的分子量根据凝胶层析的原理,对同一类型物质的洗脱特征与组分的分子量有关。流过凝胶柱时,按分子大小顺序流出,分子量大的走在前面。洗脱体积Ve是该物质分子量对数的线性函数,可用下式表示:Kav=-blgMr+c式中,b与c为常数,Mr为分子量。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线,称为“选择曲线”,曲线的斜率说明凝胶性质的一个很重要的特征。
依据球形蛋白质分子的大小、洗脱体积、速率的差异将各自分开,以标准分子制作的洗脱曲线,以其Ve及Kav值判断测定样品的分子量。图示12400-67000的几种标准蛋白质的㏒M、Kav的标准曲线。
0.20.40.60.8KavLogM4.84.
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