第十四章 维生素类药物的分析

第九章维生素类药物的分析维生素：是维持人体正常代谢机能所必需的微量营养物质。人体不能合成维生素。如果人体缺少某种维生素，就会引起维生素缺乏症，而影响人体的正常生理机能。例如:VA缺乏—夜盲症VB1缺乏—脚气病VitA、D2、D3、E、K1等脂溶性水溶性VitB族(B1、B2、B6、B12)VitC、叶酸、烟酸、泛酸VitM分类：第一节维生素A的分析-H维生素A醇-COCH3

维生素A醋酸酯-COC15H31

维生素A棕榈酸酯R:（1）环己烯+共轭多烯侧链；（2）天然VA侧链为全反式；（3）天然来源主要是鱼肝油，含量高者可达600000国际单位/克，为醋酸酯，棕榈酸酯等,目前多由人工合成。（一）为一个具有共轭多烯侧链的环己烯1.具有UV吸收具有共轭多烯侧链—紫外吸收。最大吸收波长在325~328nm，随VA存在状态以及所用的溶剂，最大吸收波长的位置有所不同。一、结构与性质维生素A325.5100%全反式新维生素Aa32875%2－顺新维生素Ab320.524%4－顺新维生素Ac310.515%2，4－顺异维生素Aa32321%6－顺异维生素Ab32424%2，6－顺相对生物效价顺反异构2.存在多种立体异构化合物VitA2VitA33.易发生脱氢、脱水、聚合反应鲸醇△或有金属离子存在时氧化↑（二）共轭多烯侧链易被氧化环氧化物VitA醛VitA酸（三）与三氯化锑发生呈色反应CHCl3（四）溶解性不溶于水易溶于乙醚，氯仿，异丙醇，环己烷等有机溶剂以及脂肪和植物油等。用于鉴别和含量测定！（一）三氯化锑反应条件：无水无醇CHCl3二、鉴别试验SbCl3水SbOCl乙醇可使碳正离子的正电荷消失蓝色紫红BP（2000）λmax为326nm一个吸收峰（二）UV法λmax为350～390nm三个吸收峰去水VitA（VitA3）↓VitA维生素A有五个共扼双键，无水乙醇溶液在326nm处有最大吸收，盐酸催化加热脱水成6个双键，故波长红移，同时在350-390nm出现3个吸收峰。讨论300400nmA(1%,1cm)10002000400080000维生素A去水维生素AUSP显色剂磷钼酸规定斑点颜色和Rf值BP对照品法（三）TLC法确认醇或酯，是醋酸酯或其他酸酯。▲例：VA和其标准品用环己烷溶解展开剂：环己烷-乙醚（80：20）薄层板：硅胶G

显色剂：SbCl3T.S.Rf值：VA醇0.08；VA醋酸酯0.41；VA棕榈酸酯0.75（一）UV法（三点校正法）三、含量测定1.概述共轭多烯的结构—具有特征的紫外吸收。相关物质—结构相似,维生素A最大吸收波长附近也有吸收，对测定有影响。

Morton和Stubbs等人提出了三点校正法。2.

原理（根据、假定）ⅰ．物质对光的吸收具有加和性，即：ⅱ．维生素A中的不相关吸收在310~340nm范围内近似一条直线。效价为维生素A1的40%，max345~350nm3.

相关物质的吸收a.

维生素A的衍生物ⅰ．维生素A2去氢维生素A效价低于维生素A1，max385~390nmb.

维生素A的氧化产物已介绍ⅱ．维生素A3去水维生素Ac.

合成时的中间体侧连有4个双键—应有种异构体。目前包括维生素A在内，共发现有6种异构体。它们是：e.

维生素A异构体d.

鲸醇维生素A醇的二聚体，没有生物活性名称顺反异构max(nm)相对效价ⅰ．新维生素Aa2-顺式32875%ⅱ．新维生素Ab4-顺31924%ⅲ．新维生素Ac2,4-二顺31115%ⅳ．异维生素Aa6-顺32321%ⅴ．异维生素Ab2,6-二顺32424%ⅵ．维生素A全反式325~328100%新维生素Aa新维生素Ab新维生素Ac异维生素Aa异维生素Ab维生素A4.波长选择：（1）1：VitA的max（如VitA酯328nm）（2）2、3：分别在1的两侧各选一点测定对象VitA醋酸酯第一法等波长差法第二法等吸收比法(皂化法)测定对象:VitA醇5.测定方法（1）基本步骤:第一步A选择

A328测定或A328校正第二步：求标示量％换算因子

方法：（2）第一法维生素A醋酸酯S环己烷9～15IU/ml溶液分别于300、316、328、340、360nm处测Ai

判断是否在326～329nm之间改用第二法是否

求算并与规定值比较规定值差值

判断差值是否超过有超过无超过计算A328（校正）用A328计算03%－15%－3%第二法第二法VitAD胶丸中VitA的含量测定精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.08262g/丸）的内容物0.2399g至250ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一20ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为:A300：0.354A316：0.561A328：0.628A340：0.523A360：0.216A300/A328：0.555A316/A328：0.907A328/A328：1.000A340/A328：0.811A360/A328：0.299求本品中维生素A的含量？A300/A328：0.564A316/A328：0.893A328/A328：1.000A340/A328：0.833A360/A328：0.3440.5550.9071.0000.8110.299+0.01－0.010+0.02+0.04－－－－－=====适用于维生素A醇（等吸收比法）第一法无法消除杂质干扰时用此法[皂化法、6/7A法]（3）第二法SKOH/乙醇皂化液VitA醋酸酯→VitA醇脂溶性植物油→甘油和脂肪酸盐水溶性乙醚提取除去植物油干扰挥干乙醚异丙醇溶解→稀释至9～15IU/ml→于300、310、325、334nm处测Ai

判断max是否在323～327nm之间取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定

计算是否

判断A300/A325是否大于0.73A300/A325小于0.73，取未皂化样品采用色谱法纯化后再测定。A300/A325大于0.73,计算A325(校正)03%－3%（二）三氯化锑比色法优点：简便快速λmax618nm～620nm标准曲线法缺点呈色不稳定（5~10s内）水分干扰与标准曲线温差≤1℃专属性差三氯化锑有腐蚀性（三）高效液相色谱法色谱柱：C18柱流动相：甲醇－水（96：4）流速:1.2ml/min检测波长与AUFS:0min-8min(330nm,0.25AUFS)用于测定VA;8min后（292nm,0.05AUFS）用于测定VE内标：VA醋酸酯掌握：维生素B1的结构特征硫色素反应含量测定方法第二节维生素B1的分析维生素B1是维生素B群中首先被发现的维生素，其最著名的缺乏症状即是脚气病。1880年日本人Takaki最早发现脚气病与食物有关，当时的日本海军以吃精制的白米为主，罹患脚气病的比例很高，当他在菜单中多增加鱼、肉、大麦、蔬菜的量时，日本海军罹患脚气病的比例便显着下降。19世纪末亚洲由於引进蒸气碾谷机，制造去外壳的白米，使得脚气病的罹患率大为增加。1911年Funk自谷壳中分离出高浓度的活性物质，并把它命名为Vitamins，以後又命名VitaminB1。1926年由Jansen及Donath分离出B1的结晶体，1936年Donath提出B1的结构式。维生素B1的分布很广泛，一般动植物及菌类皆含有维生素B1，植物中以绿色叶子、种子、全谷类、玉米等含量较丰富。白米及白面包都是经加工过程将谷类外壳去除，以增加产品外观及食品的嗜口性，但谷类之外表壳是贮存维生素B1的主要地方，以去壳之白米或白面包为主食即容易引发B1缺乏症。目前提倡的自然健康食品，风行食用不去皮的糙米及全麦面包，道理即在此。本药物主要治疗脚气病、多发性神经炎等。中国药典收载原料及其片剂和注射液。氨基嘧啶环－CH2－噻唑环(季铵盐)HClCl-一、结构与性质（一）结构1.溶解性(1)易溶于水(2)水溶液呈酸性3.UV共轭双键λmax=246nm二、性质2.硫色素反应OH-[O]硫色素正丁醇蓝色荧光4.与生物碱沉淀试剂反应杂原子的反应，能与某些生物碱沉淀试剂反应，生成组成恒定的沉淀，可用于鉴别和含量测定。5.氯化物的特性专属性反应二、鉴别试验（一）硫色素反应VitB1NaOH-H2O环合K3Fe(CN)6[O]硫色素正丁醇蓝色荧光H+OH-荧光消失3NaOH-H2O硫色素＋2H环合-2H二氢硫色素由于形成杂环的积聚，闭合共轭体系延长，其最大吸收向长波方向转移而产生荧光。VitB1H+H+H+H+（二）沉淀反应K2HgI4淡黄([B]·H2HgI4)I2-KI红色([B]·HI·I2)硅钨酸白色苦酮酸白色扇形S元素反应Cl-反应（三）其他反应VitB1NaOHΔNaSPb(Ac)2PbS↓AgNO3HNO3AgCl↓HNO3NH3·H2O溶解MnO2H+Cl2↑KI-淀粉试纸蓝色三、含量测定（一）非水溶液滴定法（原料药，ChP）[B]·Cl-·HCl+2HClO4Hg(Ac)2[B]·ClO4-·HClO4标准溶液：0.1mol/LHClO4-HAc滴定反应：指示剂：电位法消除氢卤酸盐对滴定的干扰（二）UV法200250300nmA12341－0.1mol∙L-1HCl；2－水；3－缓冲液（pH=7）4－乙醇维生素B1的紫外吸收图谱λ片剂、注射剂A=ECLChPHCl溶液中W：g；标示量：规格g/片V：ml；标示量：规格g/ml差示分光光度法：pH7：λmax＝266nm，E％1cm为255232nm，E％1cm为345pH2：λmax＝246nm，E％1cm＝421λ200250300nmA1201盐酸液(pH=2.0)2缓冲液(pH=7.0)3差示光谱λ200250300nmA1230-0.2以pH2溶液为样品液，相同浓度的pH7溶液为参比液得到的差示光谱图中，λmax为247nm.故测定波长选择247nm,通过测定△A(pH2-pH7),计算含量。（三）硫色素荧光法1、原理VitB1铁氰化钾NaOH硫色素异丙醇荧光激发波长365nm发射波长435nm2、方法与计算+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇+NaOH+铁氰化钾+异丁醇+NaOH+异丁醇SdAb对照液供试液讨论非定量完成，但一定条件下，生成硫色素与维B1

浓度成正比，因此可用于含量测定。专属性强，不受氧化产物影响。氧化剂除铁氰化钾外，可使用氯化汞，溴化氰。掌握：维生素C的结构特征鉴别检查碘量法测定含量的方法第三节维生素C的分析L－抗坏血酸一、结构与性质（一）结构二烯醇：强还原性内酯：碱性下水解两个手性碳(C4,C5)1.溶解性易溶于水（二）性质2.酸性

C3上的羟基受共轭效应的影响，酸性较强，pKa=4.17C2上的羟基因邻位羰基的影响，酸性较弱，pKa=11.57

所以抗坏血酸一般表现为一元酸，能与NaHCO3作用生成钠盐。二烯醇结构二酮基结构二烯醇结构3.还原性从VitC结构看，与糖类化合物十分相似。其结构中的二烯醇结构使其化学性质非常活泼，可以反复接受和释放质子，具有既易氧化有能还原的可逆性质。氧化为去氢抗坏血酸，加氢又复变为抗坏血酸。在pH7以上，受碱的催化作用，很快继续水解为二酮古洛糖酸盐，在强酸性溶液中也能进行此反应。有活性有活性无活性L－抗坏血酸L－去氢抗坏血酸L－二酮古洛糖酸H+OH-D-抗坏血酸与L-抗坏血酸理化性质相似，常作为食品中的抗氧化剂，但其生物活性只有L-抗坏血酸的5％。手性C（C4、C5）4.旋光性**维生素C（L-抗坏血酸）D-抗坏血酸与碱反应5.水解反应糖类的显色反应结构与糖类相似6.具糖的性质H+Δ脱水糠醛糠醛衍生物酚类显色VitCH+脱水糠醛吡咯蓝色50℃7.UV特征OH-H+λmax265nmλmax243nm利用还原性：与氧化剂的反应二、鉴别试验（一）与AgNO3反应（二）与2，6-二氯靛酚反应(ChP2010)氧化型玫瑰红色还原型蓝色(ChP2010)AgNO3VitC银镜2，6-二氯靛酚VitC无色（玫瑰色）（无色）与碱性酒石酸铜反应USP与KMnO4反应（三）与其他氧化剂反应酸性酒石酸铜VitCCu2O↓红KMnO4VitCMn2+（四）糖类的反应50℃吡咯VitC三氯醋酸或盐戊糖脱水糠醛蓝色（蓝色）(糠醛)（戊糖）50℃(吡咯)-H2OBP0.01mol/LHCl（五）UV三、杂质检查（一）溶液的澄清度与颜色检查（二）铁、铜离子的检查维生素C原料药片剂注射剂维生素C原料药原子吸收法糠醛缩合呈色催化Vc氧化分解指示剂淀粉指示液1、原理（一）碘量法四、含量测定利用Vc强的还原性H+取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.1mol/L）滴定，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。2、方法原料药（2）酸性环境稀醋酸

（1）新沸冷H2O减慢VitC被O2氧化速度3、讨论（3）立即滴定赶走水中O2减少O2的干扰4.滴定度计算5.附加剂干扰的排除片剂——过滤注射剂——抗氧剂——丙酮NaHSO3

(二)2，6-二氯靛酚滴定法USPJP1、原理自身指示终点法2、方法（2）快速滴定2min内

（1）酸性环境HPO3-HAc

稳定VitC防止其他还原性物质干扰（3）剩余比色测定

（定量过量）（测剩余染料）3、讨论（4）缺点

需经常标定贮存≤一周不稳定（5）专属性不强，多用于含Vc的制剂和食品的分析第四节维生素D的分析一、结构与性质（一）结构维生素D2(麦角骨化醇)维生素D3(胆骨化醇)1.性状无色针状结晶或白色结晶性粉末；无臭，无味。2.溶解性溶于有机溶剂，在植物油中略溶，水中不溶。3.不稳定性含有多个烯键，易氧化变质，效价降低，毒性增强。（二）性质4．旋光性维生素D26个手性碳原子维生素D35个手性碳原子5．显色反应甾类化合物氯仿溶液黄色红色紫色绿色6．紫外吸收特性

无水乙醇265nm维生素D2E1%1cm为460－490维生素D3E1%1cm为465－495醋酐硫酸二、鉴别试验（一）显色反应1．与醋酐-浓硫酸反应氯仿溶液黄色红色紫色绿色醋酐硫酸2．与三氯化锑反应本品1,2-二氯乙烷三氯化锑试液橙红色粉红色3．其它显色反应维生素D三氯化铁橙黄色二氯丙醇乙酰氯绿色（二）比旋度鉴别无水乙醇溶液维生素D2

比旋度为＋102.5°至＋107.5°维生素D3

比旋度为＋105°至＋112°（三）其它鉴别方法薄层色谱法HPLC法制备衍生物测熔点紫外、红外吸收光谱（四）维生素D2、D3的区别反应维生素D2

维生素D3

96%乙醇10ml取0.1ml乙醇1ml和85%硫酸5ml红色λmax570nm黄色λmax495nm三、杂质检查（一）麦角甾醇的检查维生素D290%乙醇溶液洋地黄皂苷溶液不得发生浑浊或沉淀原理麦角甾醇洋地黄皂苷沉淀（二）前维生素D的光照产物280～320nm吸收四、含量测定正相高效液相色谱法ChP含量以单位表示每单位相当于维生素D0.025μg注意：计算的是维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量测定在半暗室及避免氧化的情况下进行第一法：无干扰杂质第二法：有VA及其他杂质干扰第三法：用第二法时，前VD峰受杂质干扰仅VD峰可分离第一法内标物：邻苯二甲酸二甲酯色谱条件及系统适用性试验：填充剂：硅胶流动相：正己烷-正戊醇（997：3）检测波长：254nm无干扰杂质维生素D3△光照前维生素D3反式维生素D3维生素D3速甾醇D3与维生素D3的比保留时间分离度＞1.0＞1.0溶液组成先后进样5次，维生素D3峰面积的RSD≤2.0%0.50.61.01.1校正因子测定：维生素D的校正因子:f1=Asmi/Aims前维生素D折算成维生素D的校正因子:f2=（Asmr-f1msAr1）/（Ar2ms）含量测定：计算VD及前VD折算成维生素D的总量mi=（f1Ai1+f2Ai2）ms/As第二法第一步：皂化提取供试品OH-加热回流冷却乙醚提取乙醚提取液挥干乙醚残渣甲醇溶解供试溶液A有VA及其他杂质干扰第二步：分离收集供试品溶液ARP-HPLC维生素D前维生素D维生素A及其他杂质叠峰分离收集供试品溶液B维生素D及前维生素D第三步：按第一法进行含量测定（内标法）挥干内标的正己烷溶液溶解前维生素D变为维生素D第三法第一步：皂化提取同第二法得供试品溶液A第二步：供试品溶液ARP-HPLC维生素D前维生素D维生素A及其他杂质叠峰分离供试品溶液C收集挥干异辛烷溶解90℃、1.5h挥干正己烷溶解第三步：用第一法色谱条件按外标法计算含量用第二法时，前VD峰受杂质干扰仅VD峰可分离苯并－二氢吡喃醇第五节维生素E的分析一、结构与性质（一）结构掌握维生素E的结构特征，鉴别、检查和GC法测定含量的方法。名称R1R2相对活性α-生育酚β-生育酚γ-生育酚δ-生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1***生物效价右旋体：消旋体=1.4：10（天然品）（合成品）dl－α－生育酚醋酸酯（二）性质1、易溶于有机溶剂，不溶于水2、UV3、酯键易水解△VitEH+orOH-生育酚[O]醌型化合物（一）硝酸反应二、鉴别试验75℃15´VitEHNO3生育酚[O]生育红（橙红）生育红（橙红色）生育酚HNO3强氧化剂（二）三氯化铁－联吡啶反应VitEKOHΔ生育酚Fe3+[O]对-生育醌Fe2+联吡啶红色生育酚对-生育醌[O]弱氧化剂红色λmax=284nmλmin=254nm0.01%无水乙醇中（三）UV法维生素EUV图200300nm01.0A薄层板硅胶G展开剂环己烷-乙醚（4：1）显色剂硫酸（105℃5′）VitERf

=0.7（四）TLC法（二）生育酚硫酸铈滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黄→灰紫）1.原理利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈.三、杂质检查2.试剂（一）酸度游离醋酸，酸碱滴定检查（B生育酚=430.8）例取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过1.0ml。3.限量（三）有关物质

维生素E（合成型）GC（与含量测定中色谱条件相同）（四）残留溶剂

维生素E（天然型）GC正己烷四、含量测定（一）GC法1、GC特点选择性好灵敏度高速度快分离效能好挥发性低、不稳定、极性强→衍生化。载气：N2固定液：硅酮（OV-17）担体：硅藻土或高分子多孔小球柱温：265℃检测器：氢火焰离子化检测器(FID)内标：正三十二烷n≥500R≥2内标法加校正因子2.VitE测定的色谱条件1溶剂正己烷；2内标正三十二烷；3维生素E123内标法供试液（样品+内标）内标物对照液（对照+内标）是样品中不存在的物质与被测组分峰靠近能与各组分完全分离与被测组分的量接近BPGC内标正三十二烷R≥1.4USPGC内标十六酸十六醇酯R≥1.0JPHPLC外标dl－α－生育酚醋酸酯R≥1.4样品→dl－α－生育酚固定相→十八烷基硅烷键合硅胶流动相→甲醇-水（49：1）检测波长→292nmR＞2.6RSD≤0.8%（二）RP-HPLC法（外标法）JP总结（重点）VA：鉴别---三氯化锑反应含量测定---三点校正法（第一法）原理前提条件波长的选择测定结果的判断计算VB2：鉴别---硫色素反应含量测定---非水滴定法（原料）紫外分光光度法（制剂）硫色素荧光法（USP）VC：鉴别---1.利用还原性硝酸银2、6-二氯靛酚高锰酸钾碱性酒石酸铜2.糖类反应含量测定---碘量法原理条件干扰消除VE：鉴别---1、硝酸反应：条件、现象2、三氯化铁-联吡啶反应杂质检查---生育酚（铈量法）原理计算含量测定---气相色谱法（中国药典方法）1．在三氯醋酸或盐酸存在下，经水解、脱羧、失水后，加入吡咯即产生蓝色产物的药物应是A.氯氮卓B.维生素AC.普鲁卡因D.盐酸吗啡E.维生素C2．中国药典（2010年版）采用以下何法测定维生素E含量A.酸碱滴定法B.氧化还原法C.紫外分光光度法D.气相色谱法E.非水滴定法3．中国药典（2010年版）采用气相色谱法测定维生素E含量，内标物质为A.正二十二烷B.正二十六烷C.正三十烷D.正三十二烷E.正三十六烷4.下列药物的碱性溶液，加入铁氰化钾后，再加正丁醇，显蓝色荧光的是A.维生素AB.维生素B1

C.维生素CD.维生素DE.维生素E5．既具有酸性又具有还原性的药物是A.维生素AB.咖啡因C.苯巴比妥D.氯丙嗪E.维生素C6.维生素C的鉴别反应，常采用的试剂有A.碱性酒石酸铜B.硝酸银C.碘化铋钾D.乙酰丙酮E.三氯醋酸和吡咯7.测定维生素C注射液的含量时，在操作过程中要加入丙酮，这是为了A.保持维生素C的稳定B.增加维生素C的溶解度C.使反应完全D.加快反应速度E.消除注射液中抗氧剂的干扰8.能发生硫色素特征反应的药物是A.维生素AB.维生素B1

C.维生素CD.维生素EE.烟酸9．使用碘量法测定维生素C的含量,已知维生素C的分子量为176.13，每1ml碘滴定液(0.1mol/L)相当于维生素C的量为A.17.61mgB.8.806mgC.176.1mgD.88.06mgE.1.761mg10-14可发生以下反应或现象的药物为A.维生素B1B.维生素CC.两者均能D.两者均不能10.与碘化汞钾生成黄色沉淀11.麦芽酚反应12.在乙醚中不溶13.与2,6-二氯靛酚反应使颜色消失14.硫色素反应ADCBA16．中国药典（2010年版）规定维生素A的测定采用紫外分光光度法（三点校正法），此法又分为A．等波长差法B．等吸收比法C．6/7A法