第四章-蛋白质共价结构

第四章蛋白质及其共价结构第一节蛋白质通论1838年Mulder研究了血清、蛋清、蚕丝等物质的元素组成后,发现它们均可以用C40H62N10O12来表示,命名为“Protein”(意为totakethefirstplace),并发展成“基团”学说。一、蛋白质化学研究史19世纪末从蛋白质水解产物分离得到了

13种氨基酸,基团学说灭亡。1902年Fischer,Hofmeister同时提出肽键理论。1924年Svedberg发明超离心机。30年代Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽。1950年Pauling提出蛋白质的二级结构的基本单位：α-螺旋和β-折叠。1953年Sanger确定了牛胰岛素的一级结构。1958年Perutz&Kendrew用X光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构。1961年Anfinsen证明蛋白质的一级结构决定其立体结构。80年代蛋白质工程的兴起。1997年蛋白组研究的概念。1999年蛋白质芯片技术出现。对蛋白质化学有突出贡献的Nobel奖获得者1902年H.E.Fischer(德，化)肽键理论，多肽合成1910年A.Kossel(德，医)组氨酸、组蛋白的发现，碱基的发现1915年W.H.Bragg/W.L.Bragg(德，物）用X射线测

定晶体物质结构1926年T.Svedberg(瑞，化)用超离心手段决定蛋白质的分子量1946年J.B.Summer(美，化)蛋白质酶的结晶，证明酶的本质为protein1948年A.W.K.Tiselius(瑞，化)电泳装置的开发，血清蛋白的研究1952年A.J.P.Martin/R.L.M.Synge(英，化)分配层

析发明，氨基酸的分离1954年L.Pauling(美，化)蛋白质二级结构，抗原抗体

反应理论1958年F.Sanger(英，化)胰岛素一级结构的测定1962年M.F.Perutz/J.C.Kendrew(英，化)X射线确

定蛋白质的立体结构1972年G.M.Edelman/R.R.Porter(美，医〕抗体的化学

构造与功能的解明1972年W.H.Stein/S.More(美，化)RNase的一级结构

和活性中心的解明1972年

C.B.Anfinsen(美，化)蛋白质的一级结构决定

其立体结构1998年S.B.Prusiner(美，医)Prion:蛋白立体结构

的变化导致疾病蛋白质（protein）是由一条或多条具有确定氨基酸序列的多肽链组成的、具有特定空间结构的生物大分子。这类生物大分子大多数具有生理活性，少数作为结构支持物质。蛋白质的多肽链是由几十至数百个α-氨基酸通过脱水缩合形成酰胺键连接而成；各种氨基酸在蛋白质中按特定的顺序排列使得蛋白质能够形成特定空间结构。二、蛋白质及其化学组成构成蛋白质的基本氨基酸只有20种，正是这20种基本氨基酸的不同重复和排列形成生命世界中数以万计的形形色色的具有各种功能的蛋白质。蛋白质含C、H、O、N、S等元素，有的蛋白还含P、Fe、Zn、Cu等其他元素。不同蛋白质的组成和结构不同，但各元素所占的百分数基本一致，如蛋白质的平均含氮量为16%。可据此数据计算样品中蛋白质的含量。碳氢氧氮硫其它

50%7%23%16%0-3%微量

蛋白质的含量=蛋白氮×6.25

三、蛋白质的基本组成单位氨基酸是蛋白质的构件分子。蛋白质经强酸、强碱、酶水解后，可以得到多种氨基酸。在动植物组织中可以分离得到26～30种不同的氨基酸。第一个氨基酸早在两个世纪前就已经被发现，而最后一个氨基酸在1935年才发现。直到1965年才搞清楚，只有20种氨基酸才是合成蛋白质的原材料（称为Primaryaminoacid）。（一）按化学组成分:1.单纯蛋白(simpleprotein)：也称简单蛋白质，完全由氨基酸组成的蛋白质。

2.缀合蛋白(conjugatedprotein)也称结合蛋白质，由蛋白质和非蛋白质两部分组成，非蛋白质部分称为辅基（prostheticgroup）或配基(ligand)。四、蛋白质的分类1.单纯蛋白(simpleprotein)1).清蛋白albumin溶于水、盐、酸、碱溶液,加热凝固(血清)2).球蛋白globulin溶于盐、酸、碱溶液,

加热凝固(血清)3).谷蛋白glutelin溶于酸、碱溶液(谷种)4).谷醇溶蛋白prolamin溶于70-90%酒精、酸、碱溶液(谷种)5).硬蛋白scleroprotein不溶(毛、发、爪、角等)6).组蛋白histone溶于水、酸溶液

(细胞核)7).鱼精蛋白protamine溶于水、酸溶液

(精子)8).溶菌酶9).核糖核酸酶2.缀合蛋白(conjugatedprotein)1).核蛋白nucleoprotein含核酸(细胞核)2).磷蛋白phosphoprotein含有磷酸如：酪蛋白3).脂蛋白lipoprotein含lipid(动植物细胞)4).金属蛋白（metalloprotein）含金属，如：铁蛋白含Fe。5).糖蛋白glucoprotein含糖及其衍生物

(动植物细胞)6).血红素蛋白（hemoprotein）含血红素辅基7).黄素蛋白（flavoprotein）含黄素辅基（FAD或FMN）如琥珀酸脱氢酶（含FAD）。可分为可溶性蛋白质、醇溶性蛋白质和不溶性蛋白质。可溶性蛋白质是指可溶于水、稀中性盐和稀酸溶液，如清蛋白、球蛋白、组蛋白、鱼精蛋白等。醇溶性蛋白质是一类不溶于水而溶于70％～90%乙醇的蛋白质，如谷醇溶蛋白。不溶性蛋白质既不溶于水、稀盐溶液，也不溶于一般有机溶剂，如角蛋白、胶原蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。（二）按溶解度的蛋白质分类

（三）按形状的蛋白质分类

蛋白质根据形状可分为

1.纤维蛋白（fibrousprotein）

2.球蛋白（globularprotein）

3.膜蛋白（Membranous、protein）纤维蛋白质分子的长短轴具有较大的比例（>10），呈规则性细棒状或纤维状。这类蛋白质在机体内主要起结构作用，如角蛋白、胶原蛋白、丝蛋白、弹性蛋白，他们不溶于水和稀盐溶液。还有一些纤维状蛋白质如肌球蛋白和血纤蛋白原是可溶性的，在体内具有生理活性。球状蛋白质分子的长短轴比例比较接近（≤3～4）；结构紧密，类似球形或椭球形，在机体内呈溶解状态，执行生理功能。细胞中的绝大多数可溶性蛋白质都属于球状蛋白质如血红蛋白、胞质酶类、细胞因子等。膜蛋白则定位于各种生物膜上，其结构有限，到目前为止，只有全α-螺旋或全β-折叠结构，一般由多个结构域组成，但至少有一个结构域是脂溶性的，如细菌视紫红质。1.酶类占细胞内蛋白质种类的绝大部分2.运输蛋白

albumin,hemoglobin,transferrin等3.收缩运动蛋白actin,myosin,tubolin等4.激素蛋白insulin,growthhormone等5.细胞因子EGF,IL-2等6.受体蛋白insulinreceptor7.毒素蛋白choleratoxin,ricin,pertussist.

8.防御蛋白IgG等9.营养贮藏蛋白prolamine,glutelin等10.结构蛋白keratin,collagen等11.特殊蛋白甜蛋白、抗冻蛋白、弹性蛋白等（四）按功能的蛋白质分类法

1.活性蛋白质（activeprotein）

包括生命活动过程中一切有活性的蛋白质以及它们的前体分子，绝大多数蛋白质属于活性蛋白质，包括酶、激素蛋白、运输蛋白（转运蛋白）、贮存蛋白、运动蛋白、保护或防御蛋白、受体蛋白、控制生长和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。

以上功能又可归纳为两类：2.非活性蛋白质（passiveprotein）对生物体起支持和保护作用，主要指硬蛋白包括角蛋白、胶原蛋白、丝蛋白、弹性蛋白等。五、蛋白质的功能

1.生物催化剂

2.信息传导3.调节基因表达的调控的转录因子4.转运5.运动

6.储藏7.结构物质8.保护9.特殊功能六、蛋白质结构的组织层次1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次:

一级结构primarystructure：指的是多肽链共价主链的氨基酸顺序。

二级结构secondarystructure：指的是多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象。如纤维状蛋白质中的α-螺旋和β-折叠片。

三级结构tertiarystructure：是指多肽链借助各种次级键（非共价键）盘绕成具有特定肽链走向的紧密球状构象。

四级结构quanternarystructure：是指寡聚蛋白质中各亚基之间在空间上的相互关系或结合方式。寡聚蛋白质中各个亚基又有自己特定的三维构象。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。

蛋白质一、二、三、四级结构示意图七、蛋白质的大小蛋白质是相对分子质量很大的生物分子，不同蛋白质的相对分子质量变化范围非常大，从约6000到1×106甚至更大。对于特定的蛋白质而言其相对分子质量是不确定的。原因在于蛋白质分子不同于其他分子，其分子的概念有时是不确定的。对于单体蛋白质来说不存在上述问题，对于寡聚蛋白质来说其分子质量是与其分子概念密切相关的。蛋白质、多肽和寡肽这些名词的含义在一定程度上有重叠，经常容易混淆。

1.肽和肽键定义一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合而成的化合物称肽。氨基酸之间脱水后形成的键（酰胺键）称肽键。构成肽的每一个氨基酸单位因脱去1分子水被称为氨基酸残基。多个氨基酸通过肽键连接起来的链状物称肽链。根据肽链的长短分寡肽、多肽、和蛋白质。第二节肽蛋白质和肽以肽键方式连接有以下依据：1.蛋白质中游离的α-羧基和α-氨基很少。2.人工多肽能被蛋白酶水解。3.蛋白质也有双缩脲反应。4.人工多肽与蛋白质光谱一致。5.人工合成蛋白质—牛胰岛素。肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连

当两个氨基酸通过肽键相互连接形成二肽，在一端仍然有游离的氨基和另一端有游离的羧基，每一端可连接更多的氨基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、不带支链的寡肽（20个氨基酸残基以下）和多肽（多于20个氨基酸残基）和蛋白质（多于50氨基酸残基）。多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧基，除非首尾相连形成环肽。

肽链表示法：游离α-氨基在左，游离α-羧基在右，氨基酸之间用“-”表示肽键。

H2N-丝氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）Ser-Leu-Phe≠

Phe-Leu-Ser2.多肽与蛋白质的区别根据肽链的长短依次称为寡肽、多肽和蛋白质，通常相对分子质量在1500以下，称谓“寡肽”；相对分子质量在1500～6000，为多肽；相对分子质量在6000～1×106，为蛋白质。在很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。区别：蛋白质表现功能需要有特定的空间构象，多肽则不需要形成稳定的空间构象；分子量的差别。根据蛋白质相对分子质量可以初步计算蛋白质中氨基酸残基的数目：如相对分子质量为12100的蛋白质其氨基酸残基为110个（12100/110）。

20个氨基酸平均相对分子质量为138；蛋白质中较小的氨基酸较多（Gly75最小、Trp204最大），蛋白质中氨基酸平均相对分子质量为128，成为氨基酸残基时再脱去一分子水，蛋白质中氨基酸残基平均相对分子质量为110。3.活性肽具有天然生物活性的肽。（1）谷胱甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG-2H﹢2H（2）催产素和加压素均为9肽，第2位和第7位氨基酸不同。催产素使子宫和乳腺平滑肌收缩，具有催产和促使乳腺排乳作用。加压素促进血管平滑肌收缩，升高血压，减少排尿。（3）促肾上腺皮质激素（ACTH）

39肽，活性部位为第4～10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（4）脑肽

脑啡肽具有强烈的镇痛作用（强于吗啡），不上瘾。

Met-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-脑啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

β-内啡肽（31肽）具有较强的吗啡样活性与镇痛作用。（5）胰高血糖素由胰岛α-细胞分泌（β-细胞分泌胰岛素），29肽，调节维持血糖浓度。

（6）短杆菌肽S(环十肽)

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu由细菌分泌的多肽，有时也都含有D-氨基酸和一些不常见氨基酸，如鸟氨酸（Orn）。

（7）鹅肌肽和肌肽在骨骼肌中丰富，功能尚不清楚。鹅肌肽（anserine）：β-Ala-1-Me-His

肌肽（carnosine）:β-Ala-His4.肽键的特点多肽的主链结构都是一样的，不同之处在于其侧链R基的序列不同。多肽链的主链骨架（mainchain）是通过-N-Cα-C-序列重复排列而成，这里N是酰胺氮，Cα是氨基酸残基的α碳，C是羰基碳。肽键的化学本质是酰胺键，肽链中的酰胺基称为肽基（peptideqroup）或肽单位（peptideunit）。理论上肽链主链（-N-Cα-C-）上的3种键（N-Cα键，Cα-C键和羰基

C-N）都是单键，所以绕多肽主链上的任一共价键都可以发生旋转。肽基CαCHδ﹢NCαδ-O由于酰胺氮孤电子对离域和羰基碳轨道重叠,酰胺氮和羰基氧之间发生共振作用形成共振杂化体。C-N处于平面sp2杂化；C-O由一个σ和一个π键连接C-N参于π键形成，羰基O留有一个孤电子对，带负电荷共振杂化的结果：(1)具有部分双键的性质（40％），限制肽键的自由旋转。(2)使得组成肽基的4个原子和2个相邻的Cα原子倾向于共平面，形成所谓多肽主链的酰胺平面也称肽基平面或肽平面。(3)共振双键键长0.133nm比典型双键长,比单键短。肽键平面典型C=N为0.125nm(4)杂化中间状态，N带部分正电荷（0.28），O带部分负电荷（0.28）。

(5)肽平面内两个Cα可以存在顺反构型。在反式构型中，两个Cα原子及其侧链R基团彼此远离，而在顺式构型中它们相互接近，引起Cα上的侧链R基之间的空间位阻，所以反式构型比顺式稳定，两者相差8kJ/mol。但是X-Pro是例外。

5.肽的理化性质1）两性解离与等电点肽与氨基酸一样具有酸、碱性质，它的解离主要取决于肽链的末端氨基、末端羧基和侧链R基。由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之间的距离比氨基酸中的大，因此它们之间的静电引力较弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK变化不大。

可解离功能团推测的pKa值α-COOH3.7侧链COOH（Glu或Asp）4.6咪唑基（His）7.0α-+NH37.8-SH（Cys）8.8酚OH（Tyr）9.6ε-+NH3（Lys）10.2胍基（Arg）>12根据模型化合物得到的数据推测的多肽链中可解离功能团的pKa值多肽的滴定曲线比较复杂，很难用单个侧链基团的解离来分析。根据Henderson-Hasselbalch方程

pH

=

pKa

+

lg([A-]/[HA])在给定的pH下，总是可以确定每个侧链基团占优势的离子状态。当溶液pH大于解离侧链的pKa值时，占优势的离子形式是该侧链的共轭碱（pH>pKa→[HA]<[A-]），反之占优势的离子形式是共轭酸（pH<pKa→[HA]>[A-]）。肽的等电点：当溶液中多肽所携带的净电荷为零时，该溶液pH就是该肽的等电点。肽的等电点计算：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0，ε-NH+3pK10.6，请计算四肽Ala-Ala-Lys-Ala的等电点。pI=(8.0+10.6)/2=9.3溶液的pH功能团解离（带电）状况占优势离子的静电荷α-COOH侧链COOHα-NH2ε-NH2<3.5—COOH—COOH—+NH3—+NH3+23.7～4.5—COO-—COOH—+NH3—+NH3+14.5～7.8—COO-—COO-—+NH3—+NH307.8～10.2—COO-—COO-—NH2—+NH3-1>10.2—COO-—COO-—NH2—NH2-2甘氨酰谷氨酰赖氨酰丙氨酸

(H2N-Gly-Glu-Lys-Ala-COOH

)的酸碱性质分析2）双缩脲反应3）肽键的紫外吸收 210～230nm双缩脲＋碱性CuSO4溶液紫色第三节蛋白质的一级结构一、蛋白质一级结构定义1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序说明清楚。一级结构中包含的共价键（covalentbond）主要指肽键（peptidebond）和二硫键（disulfidebond）。二十世纪四十年代起，许多人不遗余力从事蛋白质的一级结构研究，Sanger是第一个将一个蛋白质（胰岛素）的所有氨基酸的排列顺序通过高度的实验技巧分析确定出来。Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaB链15710151920212530Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn15102015A链711621SSSS牛胰岛素的化学结构S————————S二、蛋白质一级结构的内容1.多肽链的数目。2.每条肽链中氨基酸的排列顺序。3.二硫键的数目和位置（链内、链间）。牛胰岛素由51个氨基酸残基组成：A链：21个氨基酸残基B链：30个氨基酸残基A链和B链间2对-S-S-键A链内1对二硫键。三、蛋白质一级结构测定的步骤1.蛋白质分子中多肽链的数目2.多肽链及二硫键的拆分与保护(亚基分离)3.多肽链氨基酸组成分析4.多肽链末端分析5.多肽链裂解成肽段（多种方法的部分水解）6.测定肽段氨基酸序列7.重叠肽段方法排序8.二硫键位置的确定１.蛋白质样品必须均一，纯度在97%以上，同时必须知道其相对分子质量、其误差允许在10%。２.测定某一具体蛋白质的氨基酸序列时要解决的问题各有不同，以上步骤是蛋白质测序中普遍应用的策略。一级结构测定要点1.确定蛋白质分子中多肽链的数目根据蛋白质N-末端或C-末端氨基酸残基的摩尔数和蛋白质的摩尔数，可以确定蛋白质分子中的多肽链数目。如果蛋白质由一条多肽链构成，其末端氨基酸残基的摩尔数应与蛋白质的摩尔数相等。如果前者是后者的倍数，说明该蛋白质分子是由多条多肽链组成。如果存在多种N-末端或C-末端氨基酸残基，表明该蛋白质由多条不同的多肽链组成。2.多肽链及二硫键的拆分与保护对于由一条以上多肽链构成的寡聚蛋白质，可用变性剂如8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，使各亚基拆开。如果多肽链（亚基）间是通过共价二硫键（-S-S-）交联的，则可采用氧化剂或还原剂将二硫键断裂，如胰岛素（含两条多肽链）和α-胰凝乳蛋白酶（含3条多肽链）等。3.多肽链氨基酸组成分析取经分离纯化的多肽链部分样品，进行完全水解，测定它的氨基酸组成（aminoacidcomposition），并计算出各种氨基酸残基的数目。测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。４.多肽链末端分析取经分离纯化的多肽链的部分样品，进行末端残基的鉴定，以便建立两个重要的氨基酸序列参考点。5.多肽链裂解成肽段用两种或多种不同的裂解方法，将每条多肽链样品降解成两套或多套相互重叠的肽段。对每套肽段进行分离、纯化，并进行氨基酸组成和末端氨基酸残基分析。6.测定肽段氨基酸序列常用的肽段测序方法为Edman降解法。根据Edman降解法的原理，已设计有商品化的氨基酸自动序列分析仪。质谱法。核苷酸序列测定。7.重叠肽段方法排序利用两套或多套肽段的氨基酸序列彼此间有交错重叠，可以重构出原来的完整多肽链的氨基酸序列。

8.二硫键位置的确定采用对角线电泳技术，确定多肽链间或链内二硫键的位置。

N末端分析法1.Sanger法2.Edman法3.Dansylchloride法4.酶降解法Sanger试剂(FDNB)标记N末端酸水解稳定留在有机溶剂相有机溶剂相抽提Edman降解法DABITC：有色Edman试剂在Edman试剂上加发色基团有机溶剂相抽提有机溶剂相抽提丹磺酰氯法（DNS法）灵敏度110-9mol

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断末端氨基酸的序列。酶解法末端测序亮氨酸氨肽酶：焦谷氨酸氨肽酶：羧肽酶A：水解除Pro、Arg、Lys之外的AA羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶Y：任何一个AA

氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法

AlaValGlyAla-Val-Gly亮氨酸氨肽酶（Leucineaminopeptidase,LAP）专一性:A=非极性氨基酸时快A=其它氨基酸时慢ABN端A=Leu时最快焦谷氨酰胺肽酶C末端的分析1.肼解法(hydrazine)2.还原法3.酶降解法

蛋白质与无水肼加热

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

||Rn-1Rn

----NH-CH-CONH-NH2+NH2-CH-COOH||Rn-1Rn＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有机溶剂而被去除、或用苯甲醛沉淀去除多种方法确定硼氢化锂还原法

羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法羧肽酶A：水解除Pro、Arg、Lys之外的AA羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶Y：任何一个AA二硫键的切割与保护1.过甲酸〔performicacid〕

不可逆－CH2SO3H2.亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆－R1-S-S-R2

＋

SO3-

R1-S-+R2-S-SO33.还原＋取代保护不可逆巯基乙醇或DTT＋8mol/L尿素或6mol／L盐酸胍＋碘乙酸－S-CH2-COOH通常采用β-巯基乙醇处理（pH89,室温下放置数小时）,可以使-S-S-定量还原为-SH。然后用碘乙酸保护-SH，防止发生氧化。多肽链的专一性裂解化学裂解法:1）溴化氰断裂CNBr只断裂由甲硫氨酸残基的羧基参加形成的肽键。由于大多数蛋白质只含有很少的甲硫氨酸，因此CNBr裂解产生的肽段不多。

这些肽段可以用胰蛋白酶处理使成更小的肽段。断裂反应在70％甲酸中进行，使卷曲的多肽链松散，暴露甲硫氨酸侧链，有利于和CNBr发生作用。溴化氰基锍甲基硫氰酸肽酰高丝氨酸内酯溴化亚氨内酯2）羟胺断裂：羟胺（NH2OH）在pH9下能专一性地断裂Asn-Gly之间肽键。但专一性不很强，Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分裂解。反应式如下：酶解方法：用于肽链断裂的蛋白水解酶是一种肽链内切酶或叫内肽酶（endopeptidase）。常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（也称糜蛋白酶）、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶等。1）胰蛋白酶（trypsin）胰蛋白酶的专一性强，只断裂由Lys或Arg残基的羧基端肽键，产生以Arg和Lys为C-末端残基的肽段。通过化学修饰将待测多肽链中Lys残基或Arg残基的侧链基团保护起来，可以减少胰蛋白酶的作用位点。用氮丙啶处理多肽链将Cys残基修饰成S-氨乙基半胱氨酸（AECys）残基，可增加多肽链中胰蛋白酶的断裂点。2）胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）胰凝乳蛋白酶又称糜蛋白酶，其专一性不如胰蛋白酶强，可以断裂Phe、Trp和Tyr或其他疏水性氨基酸残基的羧基端肽键。如果断裂的肽键附近存在碱性基团，可以增强该酶的裂解能力，而酸性基团可以减弱其裂解能力。3）嗜热菌蛋白酶（thermolysin）嗜热菌蛋白酶的专一性较差，能水解疏水性氨基酸残基如Leu、Ile、Phe、Val、Tyr、Met等的氨基端肽键。4）胃蛋白酶（pepsin）胃蛋白酶的专一性也较差，能水解疏水性氨基酸残基（Phe、Leu、Trp、Tyr等）的氨基端肽键。由于二硫键在酸性条件下稳定，而胃蛋白酶的最适pH值为2，因此常用胃蛋白酶来水解肽段来确定二硫键的位置。5）其他蛋白酶葡萄球菌蛋白酶又称为Glu蛋白酶。在磷酸缓冲液（pH7.8）中，断裂Glu残基和Asp残基的羧基端肽键；在碳酸氢铵缓冲液（pH7.8）只断裂Glu残基羧基端肽键。梭菌蛋白酶又称为Arg蛋白酶，专一性裂解Arg残基的羧基端肽键，在6mol/L尿素中作用20h内仍具活力，对不溶性蛋白质的裂解将是相当有效的。木瓜蛋白酶（papain）的专一性差，对Arg和Lys残基的羧基端肽键敏。几种蛋白水解酶的专一性胰蛋白酶：R1=Lys或Arg侧链；R2=Pro抑制水解糜蛋白酶:R1=Phe或Tyr;Leu、Met、His；

R2=Pro抑制水解嗜热菌蛋白酶：R1=Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr；R2=Pro或Gly抑制水解胃蛋白酶：R1和R2=Phe、Leu、Trp、Tyr。

短肽序列测定

Edman降解法¤¤¤★★★★Edman法提供逐次减少一个残基的肽链样品。Dansylchloride法测定N末端。Edman降解与DNS-Cl结合法串联MS（质谱）法也已用于氨基酸序列测定。该方法灵敏度高，所需的样品量极少（<10-12mol水平），测定速度快，经HPLC分离后的多肽混合物可直接进样串联质谱仪，能免去繁重的多肽分离纯化工作。根据核苷酸序列推定氨基酸序列。用待测的蛋白质的抗体沉淀合成此种蛋白质的多核糖体，分离出其mRNA，再反转录成cDNA，测出cDNA的核苷酸序列后便可推测出蛋白质的氨基酸序列。一般用两种以上的方法断裂多肽样品，形成两套或以上的肽段。不同的断裂方法可以形成切口彼此错位，因此两套肽段正好相互跨过切口而重叠。肽段排序（重叠肽法）重叠肽法－－－－－－－－－－－－－－－－－多肽

酶Ⅰ→→→→

→→→→

→→→→→

→→→→

→→→→→→

→→→→→

→→→→→→

酶Ⅱ氨基酸序列找重叠肽从而推断整个肽链的氨基酸序列

所得资料：氨基末端残基H羧基末端残基S

第一套肽段第二套肽段

OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO末端残基

H

S末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推断全顺序HOWTOUSEOVERLAPS1.为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先将自由SH基封闭。2.进行专一性部分水解(如胃蛋白酶)。3.电泳

(或纸层析)分离水解产物。4.气相过甲酸法切断S-S键，作第二相电泳(或纸层析)。5.将迁移率发生变化的多肽进行测序。二硫键位置的确定法对角线电泳的原理是：把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S-断裂。这时每个含二硫链的肽段被氧化成一对含半胱氨磺酸的肽。滤纸旋转90°角在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳，大多数肽段的迁移率未变，并将位于滤纸的一条对角线上。而含半胱氨磺酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加，结果它们都偏离了对角线。对角线电泳

蛋白质测序实例四、蛋白质一级结构与功能的关系（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化蛋白质一级结构的种属差异十分明显，但相同部分氨基酸对蛋白质的功能起决定作用。根据蛋白质结构上的差异，可以判断他们在亲缘关系上的远近。

1、同源蛋白质不同生物体中行使相同或相似功能的蛋白质。序列同源（sequencehomology）：aa顺序中的相似性称为顺序同源现象。不变残基（invariantresidue）：一级结构中有许多位置的aa对所有种属来说都是相同的。可变残基（variableresidue）：其他位置的aa差异较大，称为可变残基。细胞色素c（cytochromec）2、细胞色素c的进化真核生物细胞色素c有100个左右氨基酸残基。其中有28个位置的氨基酸是不变的，包括17位和14位上的Cys和70-80位的氨基酸。细胞色素c的进化树（二）同源蛋白质的起源共同性肌红蛋白

153AAα-珠蛋白

141AAβ-珠蛋白

146AA同源序列38同源序列64丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶以及血液凝固和溶解系统的酶都属于丝氨酸蛋白酶类，具有类似的活性中心，序列同源性高，生理功能异化。（三）氨基酸序列的局部断裂与蛋白质的激活蛋白质一级结构中也有一些特定的序列能阻碍蛋白质表现出生物功能，只有将其切除后才能形成有活性的蛋白质。凝血系统主要凝血因子

因子I，纤维蛋白原

因子II,凝血素

因子III,凝血酶原酶

因子IV,钙(