第四章 性别控制技术

性别控制定义性别控制技术概况性别控制的意义性别控制的方法性别控制技术前景第四章性别控制畜牧生产中，肉、奶、蛋等重要经济性状在性别间有差异，有的是限性性状。奶牛蛋鸡长毛兔：产毛量母兔优于公兔一、性别控制定义一、性别控制定义在正常情况下，自然界动物群体公、母性别比例基本上近于1:1，保持性别比例平衡是生物进化的结果。性别控制(sexcontrol，SC)指通过人为干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。二、性别控制技术的发展概况20世纪初，McChung(1902)在研究蝗虫精细胞时，首先提出了性别决定的染色体理论。此后，Stevens和Wilson用昆虫进行一系列研究后指出，雌雄个体中不同的性染色体与性别有关，并将性染色体定义为X染色体和Y染色体。随后，许多研究证实，哺乳动物的正常性别是由一对性染色体决定的。动物个体的性别取决于受精时雌、雄配子所携带的性染色体类别。1923年，Painter证实了人类X和Y染色体的存在，指出当卵子与X精子受精，后代为雌性，与Y精子受精，后代为雄性。1955年Eichwald和Silmser发现雄性特异性弱组织相容性抗原（malespecificminorhistocompatibility-Yantigen,H-Y抗原）后，许多人致力于用H-Y抗体来控制动物性别，但后来通过其他方法验证的结果，用H-Y抗体来分离X和Y精子及胚胎性别鉴定都不理想。近交系小鼠性别间皮肤移植实验：雄性雄性、雌性雌性、雌性雄性均不发生排斥反应。雄性雌性时出现了排斥反应。表明雄鼠皮植片具有一种雄性特有的细胞表面成分。这种成分被称为雄性特异性次要组织相容性Y抗原（malespecificminorhisticmpatibility-Yantigen），简称H-Y抗原。1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论，引起了人们从染色体上寻找性别决定基因。1966年，Jacobs等发现雄性决定因子位于Y染色体短臂上1989年，Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区(sexdeterminingregionoftheYchromosome，SRY)，它的长度为35kb，编码79个氨基酸，在不同哺乳动物中有很强的同源性。SRY序列的发现是哺乳动物性别决定理论的重大突破。目前，用分子生物学方法确定胚胎细胞中是否存在SRY基因来鉴定胚胎性别的技术已进入实际应用阶段。三、性别控制的意义目的是在动物出生前即用人工方法控制其性别，以改变后代的自然性别比例，进而按照人们的意愿进行特定性别的畜禽生产，显著提高畜牧业经济效益。对高效优质的发展畜牧业具有重要意义可使受性别限制的生产性状（如泌乳性状）和受性别影响的生产性状（如肉用、毛用性状等）能获得更大的经济效益；可增强良种选育中的选择强度，加快遗传改良的进度；可以排除畜群中有害基因或不理想的基因（如避免患有伴性遗传疾病后代的出生）。四、性别控制的方法主要两方面，一是受精之前，二是受精之后。受精前的性别控制胚胎的性别鉴定胎儿出生前的性别鉴定生物技术（一）受精前的性别控制精子的分离调节授精环境的pH值控制授精时间哺乳动物精子可分为两类，一类携带X染色体(X精子)，一类携带Y染色体(Y精子)。

这两类精子在比重、体积、表面电荷、表面抗原等方面略有差异。根据这些差异，设计了诸如沉降法、离心法、过滤法、电泳法、H-Y抗原法等分离方法试图将这两类精子分开，达到控制后代性别比例的目的。精子的分离X、Y精子分记方法的发展物理分离法免疫分离法流式细胞分离法物理分离法沉积分离法电泳法层流分离法白蛋白液柱分离法传递逆流电流法Y精子F小体检测物理分离法（1）沉积分离法：根据X精子比Y精子稍重，故沉降速率稍快。电泳法：X精子带有较多的净负电荷，因此，X精子向正极移动的速度比Y精子快。层流分离法：根据X精子和Y精子具有不同的游动方式和行为来分离精子，X精子集中在液柱的始端而Y精子集中在较远的一端。物理分离法（2）白蛋白液柱分离法：在粘滞的白蛋白液柱中，Y精子的游动速率比X精子快。传递逆流电流法：用热传递和逆流沉积法结合电流的方法来分离人精子。比较轻的Y精子移动缓慢，从而分别收集到X和Y精子。物理分离法（3）Y精子F小体检测对男性染色体染色，发现Y染色体长臂发出荧光比其他染色体强，并且，在分裂期间细胞中发现很量的斑点（F小体）。39%-47%人精子呈现F小体。F小体并非在全部哺乳动物中见到，但在大猩猩和家畜精子中均发现了F小体，因此可用于家畜精子分离。免疫亲和柱层析法H-Y抗血清直接输入法免疫磁珠技术免疫学分离法1、免疫亲和柱层析法

用这种方法分离小鼠精子进行人工授精，发现H-Y-组获得4.2%的雄鼠（对照组为46.6%），H-Y+组获得92%的雄鼠。

2、H-Y抗血清直接输入法

Zavos等（1983）给家兔阴道输入H-Y抗血清，15min后进行人工授精，获得了74%的雌性仔兔；未输入H-Y抗血清的对照组，雌兔率为44.4%。

3、免疫磁珠技术

流式细胞术（flowcytometry，FCM）是近年迅速发展起来的细胞或细胞颗粒定量分析和进行细胞分类研究的新技术。流式细胞仪（flowcytometer）又称荧光激活细胞分类器（FACS）是流体喷射技术、激光光学技术、电子技术和计算机技术综合性的高科技产品。流式细胞分离法主要组件：液流系统、激光器、荧光检测器、散射光检测器、偏转板、细胞收集器以及电子控制系统和计算机系统。这种分类技术可以测定细胞的大小、数量和类型，并可依赖荧光染色测定DNA含量和蛋白质水平，同时根据其差异进行分离。流式细胞分离法理论基础：X精子DNA含量比Y精子多（人：差异为2.8％，家畜：差异3.0％～4.2％）。将精子稀释并与荧光染料Hoechst33342共培养，染料定量结合DNA。当精子通过检索仪时被定位从而被激光束激发，X精子放射出较强的荧光信号,通过仪器和计算机系统扩增、分析并分辨出X精子与Y精子。该法所获得的首例成活后代是经子宫内手术授精出生的兔子。英国剑桥动物生物有限公司最早于1993年开展用分离精子进行牛IVF研究并获得成功。分离精子的速度很慢相对于人工授精的输精量（一千万个精子）而言，它的分离速度太慢，每小时只能分离35万个精子（2001年数据）。流式细胞分离法受胎率低精子受精力比正常精子低，解冻后的活力和顶体完整率低等。分离过程不会影响受精，但可能会影响早期胚胎和胎儿的发育。原因：荧光染色、稀释、冷冻、分离前后的保存、分离过程中紫外线的照射及机械损伤等，都可能会对精子产生不利影响。现已证实，分离过程会损伤精子细胞膜，使活力、存储能力和受精能力下降。精液在分离过程中的高倍稀释，会使精子活力下降。而分离前洗脱精浆、稀释和分离都会降低精子质膜的稳定性，从而导致提前获能。虽然质膜稳定性降低可使精子能够马上具有受精能力，能立刻用于体外受精，但另一方面却缩短了精子寿命，使得精子在到达受精部位前或在体外保存过程中死亡。价格昂贵每台约25万美元。流式细胞分离法发展前景随着分离精子速度的提高，将来可以提供足够数量的用于人工授精的分离精子。例如，Beltsville公司利用新型的精子分离专用喷嘴来提高精子分离速度。在分离纯度为90％时，每小时可分离精子6百万个；如果纯度只是要求在75％～80％，那么速度可达到每小时2千万个。另一方面，由于精子分离速度慢、成本高，人们一直探讨采用只需少量精子的输精技术。如手术输精（子宫内、输卵管内）、人工授精（子宫深部、子宫颈部）、体外受精（IVF）和胞质内精子注射（ICSI）。调节授精环境的pH值Ｙ精子对疲劳和酸的耐受力较差。向前等(1996)用pH7.2的精液人工授精，结果产公犊72.3%，pH6.8产公犊39.1%。段恩奎等(1991)在兔输精前经阴道输入不同浓度和构型精氨酸改变生殖道pH，结果后代雌性比率与浓度无关，而与pH有关，pH5.22雌兔率为39.1%，pH9.83雌兔率为61.90%,但与正常性比率差异不显著。近几年来，有许多人做此方面的实验，有成功的报道，也有否定的观点。控制授精时间母牛排卵前输精易得雌性后代，近排卵时易得雄性后代，预测和实际符合率70%。猪：对22窝母猪试验，排卵前授精得母仔55.6%，排卵后授精得公仔57.3%，（P<0.05）。排卵前E2、LH比排卵后高2.3、6.3倍。改变冻精的解冻温度在一定温度范围内，冷冻精液的解冻温度与精子的活力呈正相关。冻精解冻温度越高，精子复活越快，其活力也越强，消耗的能量快而多，故存活时间短。这样相应的缩短了Y精子的寿命，而延长了X精子的寿命，并增加了与卵子结合的机会，从而提高生母率。（二）胚胎的性别鉴定性染色质鉴定法染色体组型鉴定法Ｘ连锁酶活力测定法雄性特异抗原鉴定法SRY-PCR鉴定法LAMP早期胚胎分割方法毛细管吹吸法2到8-细胞期卵裂球（有的是16细胞，应在致密化之前）显微手术法取囊胚的滋养层细胞或桑椹胚部分细胞玻璃针、显微手术刀显微操作仪简介胚胎分割1(模式:桑椹胚/囊胚)胚胎分割2（2-到8-细胞期卵裂球）注：两部片子中都不是太确切。应用现代分子生物学技术对早期胚胎进行快速、准确的性别鉴定是可行的，但由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下少量细胞，对胚胎有一定损害，经冷冻-解冻处理后仅有少量胚胎存活，导致胚胎移植的成功率下降，这就制约了提供预知性别家畜胚胎的商业化进程。1、性染色质鉴定法是世界上第一种鉴定胚胎性别的方法。Garner等人于1968年从兔胚胎中取出细胞并对其性染色质或染色质小体进行分析。此法较复杂且对胚胎损伤大，成功率甚低，同时染色质小体在许多家畜胚胎细胞中很难发现和观察。对那些可辨认性染色质(暂时失活的X染色体)的少数胚胎来说，准确性很高。在实际生产中没有多大的价值。2、染色体组型鉴定法经典胚胎性别鉴定方法。(1)采集胚胎细胞样品；(2)专门训练有素的技术人员；(3)费时。2名有经验的技术人员约需5小时才能鉴定12-15枚胚胎。难以应用于生产之中，只能主要用来验证其它性别鉴定方法的准确率。操作过程:先取少量的胚胎细胞，在含有秋水仙素的培养液中培养，使细胞的有丝分裂停留在中期；用低渗溶液使细胞膨胀，细胞膜破裂释放染色体，然后固定，用姬姆萨染色后在显微镜下观察。由于有丝分裂被阻滞在中期，故染色体缩短，形状规则，并有特异的带型。通过核型分析来鉴定胚胎性别，寻找不能与X性染色体配对的Y染色体。准确率几乎是100%3、Ｘ连锁酶活力测定法原理：早期雌胚中2条Ｘ染色体中的一条失活，在胚胎基因组激活与Ｘ染色体失活的短暂时期内，2条Ｘ染色体均可被转移，雌胚中与Ｘ关联酶浓度及活性为雄胚的2倍。小鼠8-细胞胚次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)，结果14/15的胚胎性别与HPRT活性结果一致，其中雄性准确率100%，雌性91%。测定从桑椹胚到囊胚阶段小鼠胚胎6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PP)的活性，雌性准确率为72%，雄性57%。对Ｘ染色体失活时间尚不明确,易误判。4、Ｈ-Ｙ抗原鉴定法胚胎的细胞毒性分析胚胎H-Y抗原的间接免疫荧光分析法囊胚形成抑制法4.1胚胎细胞毒性分析原理：在补体存在的情况下，H-Y抗体可以与H-Y+胚结合使其中1个或多个卵裂球溶解，或使卵裂球不规则，阻滞了胚胎的发育。将正常胚胎移植给同期化受体，所生仔鼠有86%为雌性。以破坏胚胎为代价，近年来已很少采用。

4.2间接免疫荧光分析法原理：以H-Y抗体作为一抗，二抗为山羊抗鼠IgG/FITC，依次与胚胎共培养。对胚胎无损害性。判为雄胚者有78%产雄鼠，判为雌胚者有81%产雌鼠。在牛有83%-89%的雌性鉴定准确率，猪为81%的鉴定准确率，绵羊为85%的准确率。

4.3囊胚形成抑制法原理：H-Y抗体可逆性抑制囊胚形成，与桑葚胚共培养，雌胚继续发育形成囊胚。雄胚洗去H-Y抗体，继续培养。胚胎移植后的存活力与正常胚无异，实用。雌胚移植后产生79.1%（38/48）的雌鼠，雄胚移植后产生91.3%（21/23）的雄鼠。Utsumi等（1993）用含大鼠H-Y抗体的培养液培养牛桑葚胚，核型分析证明，判为雌胚者80%-90%具XX核型，判为雄胚者80%具XY核型。

5、SRY-PCR鉴定法原理：利用雄性特异性基因探针和PCR。优点：对胚胎损害小；准确率较高，可达90%以上。方法：取少量胚胎细胞，使其DNA与已知为Ｙ染色体特异标记的互补DNA序列杂交，阳性胚为雄性，反之为雌性。犊牛雄性准确率95%，雌性准确率为93%。通过PCR扩增Ｙ染色体的特异性重复序列或SRY基因可大大增加鉴定的灵敏度、改善准确度。（三）胎儿出生前的性别鉴定在着床后某个阶段检测胎儿的性别，然后选择性的流产B型超声波：检测有无阴囊（人）/GT位置羊水穿刺术：测定羊水激素（睾丸酮）含量，分析染色体，用Ｙ染色体特异性DNA探针检测从羊水中获得的细胞，以确定性别。

（四）生物技术克隆：即核移植。用已知性别的细胞作供体，移入去核的卵母细胞中，从而发育成新个体。胚胎分割：先鉴定胚胎的性别，然后胚胎分割，将分割后的胚胎培养后移植到受体获得多个相同性别的新个体)。显微受精：给卵子注射经性别鉴定的精子。孤雌生殖：哺乳类动物已实现人工孤雌生殖五、性别控制技术前景

迄今为止，性别控制最成功的方法是流式细胞器分离X精子和Y精子法和胚胎SRY-PCR扩增法。前者由于分离速度较慢、精子活率较低，影响人工输精后的受胎率，故亟待解决这两种问题以满足人工输精的要求。SRY-PCR技术鉴定胚胎性别的方法尚需解决提高灵敏度和缩短鉴定时间的问题，加紧研制出各种家畜胚胎性别鉴定的SRY-PCR试剂盒，使这种方法的操作简单而实用。性别控制对人类和动物尤其是家畜的育种和生产有着深远的意义。在生产上，奶牛场主希望从其优质、高产的核心群中繁殖出更多的小母牛来更新奶牛群；而肉用牛场主则希望繁殖出更多的小公牛，因为公牛生长速度比母牛快，而且阉公牛肉的价格较高。对后裔测定来说，性别控制比无性别控制至少可以节省一半的时间、精力和费用。对人类来说，通过性别控制可以避免因出生与X相关隐性疾病的婴儿而造成的痛苦，如囊性纤维化（cysticfiro