第六章 发酵途径

微生物生理学

王志生工楼203angzhi1002@126.com第六章2PyruvateAcetoin发酵（fermentation）发酵和无氧呼吸发酵和不完全氧化从丙酮酸开始的几种发酵乙酰乳酸合成酶aPy氧还蛋白氧化还原酶酒精发酵A．酵母菌的酒精发酵Ⅰ型

Ⅱ型

Ⅲ型B．细菌的酒精发酵GA．酵母菌的酒精发酵—I型2CO22ATP2ADP2乙醇2乙醛2Pyr2PEPH2O2NAD+2NADH2ADP2ATP2ATP2ADP

二磷酸 果糖3-磷酸甘油醛2（二磷酸甘油酸）2（3-磷酸甘油酸）2（2-磷酸甘油酸）磷酸二羟丙酮I型正常条件下C6H12O6+2(ADP+Pi)丙酮酸脱羧酶2CH3CH2OH+2CO2+2ATP

乙醇脱氢酶A.II型(甘油发酵):加入亚适量的NaHSO3

SO3NaCH3CHO+NaHSO3

CH3CHOH磺化羟基乙醛油酯酶CH2OHCH2OHα-磷酸甘CH2OHC=OCH2O-PiCHOHCH2O-PiCHOHCH2OH+PiC6H12O6+NaHSO3

C3H8O3+C2H4OHSO3Na+CO2NADHNADDHAPA．II型(甘油发酵):加入亚适量的NaHSO3NaHSO3CO2ATPADP磺化羟基乙醛乙醛PyrPEPH2OADPATP2ATP2ADP3-磷酸甘油醛二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸G二磷酸果糖

NAD+磷酸二羟丙酮NADH

α-甘油磷酸Pi甘油α-磷酸CH2OHCH2OH甘油酯酶CH2OHC=OCH2O-PiCHOHCH2O-PiCHOHCH2OH+PiC6H12O6+NaHSO3

C3H8O3+C2H4OHSO3Na+CO2德国科学家CarlNeuberg和酵母菌II型酒精发酵

第一次世界大战甘油硝酸甘油炸药酿造厂1000吨甘油/月 耐盐藻类B.III型(甘油发酵)碱性条件,pH7.6CH3CHO发生歧化反应:2CH3CHOCH3COOH+CH3CH2OHIII型(甘油发酵)碱性条件,pH7.60.5乙醇CO2ATPADPNADHNAD+乙醛PyrPEP0.5乙酸ADPATPH2O2ATP2ADP3-磷酸甘油醛二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸G二磷酸果糖

NAD+磷酸二羟丙酮NADH

α-甘油磷酸Pi甘油III型(甘油发酵)

CH3CHO发生歧化反应:碱性条件,pH7.62CH3CHOCH3COOH+CH3CH2OH反应方程式:

2C6H12O6

2C3H8O3+CH3COOH+CH3CH2OH+2CO2酵母好氧条件下Py进入TCA循环不入乙醇途径，因为氧化磷酸化与底物水平磷酸化竞争ADP并生成更多的ATP，若保持充足供氧，则继续高速生长，实现高密度发酵。厌氧条件下，Py不进入TCA而去乙醇合成途径。因无氧，只能通过EMP途径功能，导致ATP生成量低，若保持细胞生长，只能通过EMP通量增大来满足。巴斯德效应：发酵状态酵母在通氧时糖耗下降、乙醇生产量降低；停止通气糖耗和乙醇产率大幅提高的现象。原因：供氧，ETC氧化NADH，能量得率高（36/38molATP/molGlucose，而EMP途径仅2molATP；氧充足条件是厌氧条件产能效率的18倍），细胞生长迅速，但是不用消耗那么多的Glucose即可满足细胞生长代谢的需求，而且不用生成乙醇来氧化NADH，使乙醇生成效率下降甚至停止；反之，厌氧条件下，EMP途径产能效率仅为好氧条件的1/18，即单位时间必须消耗18mol的Glucose才能达到好氧条件的产能/供能效率，所以糖耗速率是好养条件下的18倍，而且必须通过生成乙醇来氧化NADH，使得乙醇合成效率大幅度提高。当然，前提条件是：有氧q酵母代谢调控过程的研究进展很多学者已经研究了酿酒酵母对不同氮源的吸收利用的途径与机理，以及不同氮源相互之间的作用。酵母可以利用不同的氮源，但并不是每种氮源都可以很好地支持酵母的生长。氨、谷氨酞胺和天冬酞胺等为比较好的氮源，而在脯氨酸和尿素等中生长速率比较慢。酵母对一种氮源的利用首先要将其转化为谷氨酸或谷氨酞胺，以它们作为氮的供体合成其它的含氮化合物。在谷氨酸脱氢酶和谷氨酰胺合成酶的作用下谷氨酸或谷氨酰胺可以由氨作为氮的供体而直接合成。当谷氨酸作为氮源时，谷氨酞胺合成酶利用谷氨酸和从谷氨酸到a-酮戊二酸反应中生成的氨合成谷氨酞胺。氨、谷氨酸和谷氨酞胺之间的相互转化被称为氮的中间代谢途径C(netarl

Nirtogen

Metbolism，CNR)

酿酒酵母发酵条件下关键代谢酶活性分析环境的变化会在细胞内产生响应，包括基因水平、蛋白质水平、酶活性水平，代谢系统自我调控以适应环境变化。相对于研究细胞内个别化学反应的变化，对代谢体系本身所产生的系统而精细的调控的研究更重要。在不同的环境下，胞内的酶系会作出系统的调整与响应。胞内酶活性受到可逆结合的因子、共价修饰和酶浓度等因素的影响。在第一种情况下，酶上特定的位点被信号分子结合而抑制或者激活，产生构象的变化，该信号分子可能是该酶或其他酶所催化反应的底物或者产物，比如变构效应等。在共价修饰的情况下，酶的结构可以被其他酶所催化的反应来改变，比如磷酸化。mRNA转录的速率受到严格的控制，酶的活性很大程度直接反应在酶的浓度上。样品制备

样品在10000rpm，4度下离心10分钟，收集细胞。用100mM

Tris一Hcl(pH7.0)溶液洗涤2次，溶液包含20mM的KCI，5mM的MnSO4和0.1mMEDAT，然后重新悬浮在同样的溶液中(每15g湿细胞悬浮在50ml缓冲液中)。悬浮液置于冰槽中，在超声波破碎仪中超声波破碎1min。细胞碎片在10000rpm，4℃下离心分离，得到的粗细胞抽提液用来迅速测量酶活性或者保存在-20℃。酶活性检测在可控温度的分光光度计上进行。反应所需混合物加入到1cm光程的石英比色皿中，最后加入细胞抽提液或者底物达到总体积为1ml，并且启动反应。在波长340nm下测量NADH，NADPH的变化。每单位酶活性定义为每分钟每毫克蛋白质转化1umol底物所需的酶。检测原理NADPH与NADH的摩尔吸光系数一样酶活性单位为：umol/minmgprotein，可由体积酶活算出体系总酶活，再除以体系总蛋白量。每升反应体系有多少酶活NADPH是辅酶，为什么我的反应体系中没有加酶，只是加底物和NADPH，其OD值也在下降，这是为什么呢？我的反应体系体积200uL,NADPH的终溶度是0.5mMNADPH在自然状态下容易被氧化分解，加入2-巯基乙醇是还原剂，可以减少氧化加PMSF是因为PMSF（苯甲基磺酰氟）是一种蛋白酶抑制剂，可以有效的抑制菌体裂解后的释放出的丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶的活性。防止它们降解消化目标蛋白。需注意PMSF溶解于水溶液后自身会迅速降解，大约1小时会自身降解完毕即失去作用。需要每1小时补加一些新鲜的PMSF。加DTT是因为DTT（二硫苏糖醇）是一种还原剂。发酵条件PYK趋势相反，乙酸为碳源酶活性远远低于前两者，因其不在EMP系统中。酿酒酵母ICDH以NADP为辅酶酿酒酵母在发酵不同阶段和以乳酸为碳源下的

蛋白质组解析和酶活性分析第一个样品取在葡萄糖作碳源的对数生长期，此时葡萄糖正在迅速地被消耗，同时主要积累了乙醇等代谢产物。在发酵的后期，葡萄糖被

消耗光，菌体调整了体内的酶系，转而利用乙醇产生了二次生长的现象。在第10

个小时取得的样品就代表了酵母开始利用发酵前期积累的乙醇为碳源的情况。说明乙醇为碳源的基本培养基中利用酿酒酵母表达外源基因时所表现出来的优良的性态。在葡萄糖作为碳源的对数期，6-磷酸葡萄糖脱氢酶（zwf）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd)的表达量远远高于另外两个样品。这也与酶活性检测的结果相一致(G6PHD)(图3.3)图3.5的结果表明此时丙酮酸激酶的酶活性测量结果比另两种情况高很多，表明在利用葡萄糖为碳源时相对于利用乙醇和乳酸时，糖酵解途径要更活跃。这种趋势在磷酸戊糖途径的氧化阶段尤为明显。由glk和pgi基因所分别表达的葡萄糖激酶和磷酸葡萄糖异构酶是催化糖酵解中前两步，由葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖和由6-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸果糖的反应。从图3.10(a)中可以看出，在葡萄糖作碳源的对数期时，为了有效地利用葡萄糖，表现了较高的表达量，相应地在葡萄糖消耗光的后期和乳酸作碳源时表达量较低或未被检测到。由pgk、eno、pyk所分别编码的磷酸甘油酸激酶（3-磷酸甘油酸激酶催化1，3-二磷酸甘油酸转变3-磷酸甘油酸，产生1分子ATP），烯醇酶和丙酮酸激酶也都在以葡萄糖为碳源时显示出较高的表达量。在葡萄糖作为碳源的对数期，6-磷酸葡萄糖脱氢酶（zwf）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd)的表达量远远高于另外两个样品。同时在三个条件下磷酸戊糖途径的非氧化阶段却无如此明显的差别，相关的蛋白质包括转醛酶(tall)、转酮酶(tkl1，tkl2)。以上结果表明，在利用乙醇和乳酸为碳源时，糖酵解途径并不活跃，磷酸戊糖途径的氧化阶段也被大大地削弱或被阻断了。而作为NDA、NRA、色氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸等生物合成前体的4-磷酸赤醉糖和5-磷酸核糖主要由磷酸戊糖途径的非氧化阶段来提供。图3.10(a)的结果还表明，对于fba和tdh3编码的1，6-二磷酸果糖醛缩酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶由于其催化可逆的反应，既属于糖酵解途径，又对糖异生有贡献，同时提供了磷酸戊糖途径的非氧化阶段的反应物，所以在利用乙醇和乳酸时，也表现出了较高的表达量。稀释率的倒数等于保留时间可以看出在葡萄糖和甘油作为碳源时，菌体生物量得率几乎相同，而在乙酸作为碳源时生物量得率相对较低，同时CO2生成速率和02摄入速率较高，表明在这种条件下呼吸作用可能较为旺盛。PEP羧激酶催化的由OAA生成PEP的反应更是没有激活甘油作为碳源连续培养中中间代谢途径的代谢通量分布OAA到PEP占到碳流量的21%乙醛酸循环碳流占28.8%总结ED途径中，Py的羧基来自G的C1与C4磷酸葡萄糖酸脱水酶•同型乳酸发酵相关酶活性增大以维持胞内相对稳定的pH，有稳定生长的作用Why？磷酸解酮酶途径(Phosphoketolase

Pathway)

Glucose

Lactate、Ethanol、CO2肠膜明串珠菌双歧杆菌它们存在微量的醛缩酶、G-6-P脱氢酶活性基本不具备完整的EMP、HMP和ED途径磷酸戊糖解酮酶异型乳酸发酵戊糖磷酸解酮酶途径(PK途径)(PentosePhosphoketolasePathway):戊糖→木酮糖-5-P解酮→2C,3C磷酸转乙酰酶乙醛脱氢酶，指其逆反应乙醇脱氢酶，指其逆反应肠膜明串珠菌中，磷酸酮糖解酮酶5-磷酸核酮糖5-磷酸木酮糖①分解1分子葡萄糖只产生2分子ATP比EMP途径少一个②几乎产生等量的乳酸、乙醇和CO2异型乳酸发酵乳酸发酵磷酸己糖解酮（HK）途径

2葡萄糖

2葡萄糖-6-磷酸6-磷酸果糖6-磷酸-果糖4-磷酸-赤藓糖乙酰磷酸2木酮糖-5-磷酸2甘油醛-3-磷酸2乙酰磷酸2乳酸2乙酸乙酸磷酸己糖解酮酶磷酸戊糖解酮酶戊逆HMP途径同EMP乙酸激酶磷酸己糖酮解途径的特点：

①有两个磷酸酮解酶参加反应；②2分子葡萄糖分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸-甘油醛，3-磷酸-甘油醛在脱氢酶的参与下转变为Py和乳酸生成5ATP双歧杆菌中HK途径

Py羧基来自G的C3C4PyC3来自G的C1C6有一半来自C6，该C没有标记PK磷酸戊糖解酮酶途径FBP积累引起GAP积累，而GAP还从PK途径来，通过抑制6-P-G脱氢酶减少PK来水，同时增大LDH以加强下游排水，以维持FBP的相对稳定；同时，6-P-G脱氢酶抑制会引起6-P-G积累，它会抑制磷酸己糖异构酶，这样也使FBP下降并稳定。主要生成乳酸，因B区域流量抑制了。FBP下降到一定程度，其对6-P-G脱氢酶抑制作用消失或减弱，B区域出现一定流量，等量GAP（其向左去生成乳酸）和乙醇生成；同时，6-P