第五章酶分子修饰和改造

第五章酶的分子修饰和改造第一节酶化学修饰的原理和方法一、酶的化学修饰原因1．稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。2．作用的最适条件不符。3．酶的主要动力学性质的不适应。4．临床应用的特殊要求。

酶化学修饰的应用理论研究酶中特定基团之间的距离氨基酸残基的存在状态氨基酸测序确定酶活性部位氨基酸数量测定医药解除医用酶免疫源性和抗原性

提高医用酶稳定性延长医用酶体内半衰期生物技术领域改变酶最适pH

改变酶底物专一性有机溶剂可溶解酶提高酶耐热、酸、碱、有机溶剂能力二、酶修饰的方向1．核酸水平：利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造或修饰2．蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造氨基酸的置换肽链有限切除氨基酸残基的修饰等三、酶化学修饰的基本原理1．增强酶天然构象的稳定性与耐热性酶与修饰剂交联后，使酶的天然构象产生“刚性”，不易伸展打开，从而增强酶的热稳定性。2．保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶共价交联后，其产生的空间障碍或静电斥力能有效地阻挡抑制剂对酶的进攻，同时“遮盖”保护酶活性部位，使抑制剂和酶结合的难度增加，使酶的抗抑制剂能力增强。

三、酶化学修饰的基本原理3．维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶大分子修饰剂产生的空间障碍可阻挡蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。酶分子上许多敏感基团参与修饰反应，也减少了酶分子遭受蛋白水解酶攻击破坏的可能性。

4.消除酶的抗原性有些组成抗原决定簇的基团与修饰剂形成共价键，破坏了酶分子上抗原决定簇的结构，使酶抗原性降低乃至消除。能“遮盖“抗原决定簇和阻碍抗原、抗体产生结合反应。四、对修饰剂的了解1．修饰剂的分子量、修饰剂链的长度、对蛋白质的吸附性2．修饰剂上反应基团的数目及位置3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件五、酶性质的了解1．酶活性部位情况2．酶的稳定条件、酶反应最适条件3．酶分子侧链基团的化学性质及反应活泼性等六、反应条件的选择1．反应体系中酶与修饰剂的分子比例2．反应体系的溶剂性质，盐浓度和pH条件3．反应温度及时间七、酶修饰方法1．酶分子侧链基团的化学修饰2．有机大分子对酶的化学修饰3．蛋白质类及其他第二节酶分子侧链基团的化学修饰一、几种重要的修饰反应1.酰化及其相关反应修饰剂：乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟乙酸乙酯、O-甲基异脲等。修饰残基：氨基、羟基、酚基、巯基等。2．烷基化反应修饰剂：2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、碘甲烷、苯甲酰卤代物等。修饰残基：氨基、巯基、羧基、甲硫基、咪唑基等。3．氧化和还原反应修饰剂：氧化试剂（H2O2、N-溴代琥珀酰亚胺等）；还原剂（2-巯基乙醇、巯基乙酸和二硫苏糖醇等）修饰残基：巯基、甲硫基、吲哚基、酚基等（氧化）；二硫键（还原）。4．芳香环取代反应修饰剂：四硝基甲烷修饰残基：Tyr，Phe。二、特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1．巯基的化学修饰巯基是许多酶活性中心的催化基团形成二硫键稳定酶的结构最容易反应的侧键基团之一通过修饰可提高酶的稳定性烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺；常用N-乙基马来酰亚胺、5,5′-二硫-2-硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）。DTNB（Ellman试剂）用于定量酶分子中巯基数目。2．氨基的化学修饰Lys的氨基是酶分子中活性很高的基团，容易被修饰。常用氨基修饰试剂：乙酸酐、２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）、碘代乙酸、还原烷基、。２，４，６-三硝基苯磺酸（TNBS）可用于测定酶蛋白中Lys数量。常用２，４-二硝基氟苯(DNFB，Sanger试剂)、丹磺酰氯(DNS)修饰多肽链N末端，用于N末端的测定。3.羧基的化学修饰主要涉及谷氨酸和天冬氨酸。产物一般为含酯类或酰胺类的修饰酶。水溶性的碳二亚胺为最常用的修饰剂，可定量测定羧基含量。．咪唑基的化学修饰：焦碳酸二乙酯。．胍基的化学修饰：丁二酮和1，2-环己二酮为修饰剂。．二硫基的化学修饰：通常通过还原的方法进行修饰。7.分子内交联修饰采用含有双功能基团的化合物，如二氨基丁烷、戊二醛、己二胺等，与酶蛋白分子中两个侧链基团反应，形成共价交联，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。三、小分子修饰剂的作用1.用于酶分子结构和功能的研究2.用于改进酶性质

第三节有机大分子对酶的修饰一、概念利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性二、常使用的水溶性大分子修饰剂糖及糖的衍生物（右旋糖酐、糖肽、SephadexG-25）聚乙二醇、大分子多聚物（如乙烯酮、乙烯乙酸、丙烯酸等的单聚或共聚物）具有生物活性的大分子物质（如肝素）、蛋白质等。修饰的方法如：溴化氰法、高碘酸氮化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法和三氯均嗪法等三、举例3.1聚乙二醇及其修饰反应聚乙二醇的特点：①线性分子HO-CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2-OH；②具有良好的生物相容性和水溶性；③在体内无毒性、无残留、无免疫原性；④末端活化后可与酶产生交联；⑤覆盖在酶分子表面形成疏松的亲水外壳，导致流体动力学发生改变。（一）叠氮法将PEG的末端羟基转化为叠氮基，然后与酶反应。⑴PEG甲氧甲酰甲酯制备⑵PEG酰肼制备⑶PEG羧甲基叠氮化物制备⑷活化PEG与酶交联

（二）琥珀酸酐法用二溴代琥珀酸酐在温和碱性条件下将PEG活化，经减压浓缩得活化PEG，可与酶分子上氨基交联。（三）三氯均嗪法PEG经三氯均嗪法活化后，用石油醚抽提或减压蒸馏，制得活化PEG。（四）羰二亚胺法修饰酶分子上的羧基。3.2糖类的修饰反应（一）右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯的修饰反应1.溴化氰法右旋糖苷经溴化氰活化后，在碱性条件下与酶的游离氨基共价连接，生成修饰酶。2.高碘酸氧化法高碘酸将右旋糖苷上邻双羟基氧化成醛基，醛基再与酶分子上的氨基结合而生成修饰酶。（二）糖肽的修饰反应糖肽分子上有游离氨基，活化后能与酶分子上氨基反应。①2,3-异氰酸甲苯活化法②戊二醛法3.3合成大分子多聚物修饰酶（一）聚N-乙烯吡咯烷酮N-乙烯吡咯烷酮修饰酶时，首先要开环水解，经活化反应，才能与酶联结。（二）聚乙烯醇修饰酶聚乙烯醇与硝基苯酰氯反应后，其产物的硝基用连二亚硫酸钠还原成氨基，与酶分子中羧基共价连接。（三）聚氨基酸修饰酶聚赖氨酸修饰酶Lys上的氨基与含羧基较多的酶的羧基通过羰二亚胺产生交联。3.4天然大分子对酶的修饰作用肝素修饰酶肝素由氨基葡萄糖和两种糖醛酸组成。羰二亚胺法用羰二亚胺活化肝素分子上的羧基后，与酶上的氨基共价连接。人血清白蛋白修饰酶戊二醛法利用戊二醛双功能使白蛋白上的和酶分子上的氨基相互交联。第四节其它修饰方法及修饰酶的性质一、金属离子置换修饰1．概念：通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法称为金属离子置换修饰。2．常用离子常用二价金属离子。3．修饰方法二、肽链有限水解修饰用专一性较强的蛋白酶或肽链为修饰剂，使肽链部分水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的性质和功能。增加某些酶的活性减少或消除某些酶的抗原性。三氨基酸置换修饰将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的某些改变，从而改变酶的性质和功能。提高酶活力或增加酶稳定性。例：对β-干扰素修饰，将17位半胱氨酸→组氨酸，提高稳定性

mRNAUGU,UGC→AUG,AGCDNAACA,ACG→TCA,TCG

将A突变成T，定点突变修饰酶的性质1、修饰酶的热稳定性2、修饰酶的抗原性3、修饰酶对各类失活因子的抵抗力4、修饰酶在体内的半衰期5、最适pH6、Km的变化第五节酶的生物改造一．理论来源二．概念三．定向进化的选择策略四．定向进化的应用一．理论来源利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程化学进化生物进化二．概念随机突变+定向选择＝目标突变体细菌诱发突变的因素50

0C培养突变体库选择压力（温度）温度耐受型突变体最适生长温度为370C最适生长温度提高了！定向进化属于蛋白质的非合理设计，不需事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。定向进化不是定点突变定向进化：突变筛选

突变位点是随机的，不确定的；突变位点的数目也是不确定的；突变的效应更是不可预知的；理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的，生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。定点突变：

突变位点是确定的，突变的个数也是预知的；突变的效应可能是已知的，也可能是未知的；定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。三．定向进化的选择策略突变蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析定向进化的基本方法高突变菌株Stratagene

公司构建了缺失DNA修复3个途径的大肠杆菌菌株，基因突变率高5000倍易错PCRDNAshuffling体外定向进化四定向进化的应用1．提高酶分子的催化活力L—天冬氨酸酶定向进化研究进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶2．提高酶分子的稳定性T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃.8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃3．提高底物的专一性和增加对新底物的催化活力Beuve和Danchin展示腺苷酸环化酶突变后，鸟苷酸环化酶活力提高了4.5倍，但腺苷酸环化酶