第二章 微生物发酵制药技术

第二章微生物发酵制药技术第一节概述一、微生物发酵制药的发展简史自然发酵时期纯培养技术时期通气搅拌的好气性发酵工程技术时期人工诱变育种与代谢控制发酵工程技术时期发酵动力学和连续化、自动化发酵工程技术时期微生物酶反应合成与化学合成相结合工程技术时期发酵工程的4个阶段第一阶段1676年制成第一台显微镜——微生物的存在1857年巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的1897年毕希纳发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精——酶第二阶段对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。第三阶段20世纪40年代初，第二次世界大战爆发，青霉素迅速工业大规摸生产。深层培养、生产大规模化、多种抗生素、氨基酸、核酸发酵成功。第四阶段20世纪50年代，利用代谢调控发酵氨基酸、核酸。20世纪70年代，利用固定化酶或细胞连续发酵。20世纪80年代，基因工程、蛋白质工程、细胞融合技术等高新技术应用阶段。发酵工程制药的特点微生物菌种选育获得高产发酵的理论产量存在约10%的变量发酵过程常温常压，操作条件温和纯种培养、无菌条件生产过程是以生物体的自动调节方式进行的分子水平生产，定向发酵、突变、杂交等手段投资少、见效快发展趋势利用DNA重组技术和细胞工程技术的发展、新的工程菌和新型微生物的开发新型的生理活性多肽和蛋白质类药物：干扰素、白介素促红细胞生成素等；新型菌体制剂和疫苗。红细胞生成素

(治疗贫血)

生长激素

(促进生长)胰岛素

(治疗糖尿病)

干扰素

(抗病毒、抗肿瘤)

二、微生物发酵制药研究的内容利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。1、微生物菌体的发酵SCP、药用真菌（冬虫夏草、茯苓等）生物防治制剂（如苏云金杆菌）活性乳制剂细胞的生长与产物的积累成平行关系，生长速率最大的时期也是产物合成最高阶段三、微生物发酵药物的来源单细胞蛋白质的优点①生长繁殖迅速：生产能力可达2～6kg/（m3.h）。②不受外界条件的影响，可以人工控制工业化生产。③营养价值高：微生物细胞内蛋白质含量（占细胞干物质）：

细菌60～80％，

小球藻和螺旋蓝细菌50～65％

酵母菌40～55％，

霉菌20～50％

大豆35～40％,

小麦10～12％，牛肉18～22％此外这些微生物细胞中还含有丰富的碳水化合物和维生素、麦角甾醇、矿物质、各种酶和未知生长因子2、微生物酶发酵各种酶制剂糖化酶、α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等天冬酰胺酶：抗癌纳豆激酶、链激酶：治疗血栓青霉素酰化酶：青霉素生产需要诱导或遭受阻遏、抑制等调控作用，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需注意。3、微生物代谢产物发酵初级代谢产物：与菌体生长相伴随的产物、对菌体生长、分化和繁殖是必须的氨基酸、核苷酸、维生素、糖类等菌体对其合成反馈控制严密，一般不过量积累次级代谢产物：与菌体生长不相伴随，以初级代谢的中间产物为原料而合成抗生素、生物碱、毒素、色素、胞外多糖等结构常较复杂对环境条件敏感4、微生物转化发酵利用微生物细胞的一种或几种酶，对外源化合物的特定部位进行加工，如加入羟基、还原双键、脱氧或切断支链等。反应最显著的特点是特异性强，包括反应特异性、结构位置特异性、立体特异性。如：甾体转化：环戊烷多氢菲核的化合物可的松（Cortisone）学名：11-脱氢-17-羟皮质酮。由皮质醇分子C-11上的羟基氧化为酮基而得的一种糖皮质素。给药后在体内转变为皮质醇而发挥其强抗炎性。

四、微生物发酵药物的分类生物来源作用对象作用机制化学结构细菌真菌放线菌抗菌药抗肿瘤药抗病毒药除草剂酶抑制剂免疫调节剂抑制细胞壁合成药影响细胞膜功能药干扰蛋白质合成药抑制核酸合成药抑制生物能量反应药抗生素维生素氨基酸核苷酸甾体激素酶及酶抑制剂第二节制药微生物与产物的生物合成一、常见的制药用微生物细菌放线菌真菌细菌之大肠杆菌属(Escherichiacoli)生产天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等氨基酸类药物基因工程的载体细菌之短杆菌属(Brevibacterium)维生素B12、氨基酸、核苷酸类药物生产中常用的菌种，也是酶法合成生产辅酶A的菌种。细菌之棒状杆菌属(Corynebacterium)生产氨基酸、核苷酸类药物，用于甾体转化是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌，如北京棒杆菌AS1.299钝齿棒杆菌AS1.542细菌之芽孢杆菌属(Bacillus)生产氨基酸、核苷酸、抗生素类、维生素B12、用于甾体转化等。细菌之假单胞菌属(Pseudomonas)生产维生素B12、氨基酸、核苷酸类；进行类固醇（甾体）转化；有些菌株可利用烃类生产单细胞蛋白。细菌之乳酸杆菌属(Lactobacillus)生产抗癌类药物放线菌抗生素12000余种，60%左右来自放线菌，经济价值大。放线菌之链霉菌属(Streptomyces)灰色链霉菌(Streptomyces

griseus)

产链霉素金霉素链霉菌(Streptomyces

aureofaciens)产金霉素红霉素链霉菌(Streptomyces

erythreus)

产红霉素龟裂链霉菌(Streptomyces

rimosus)产土霉素放线菌之诺卡氏菌属(Norcadia)生产利福霉素、蚊霉素等放线菌之小单胞菌属(Micromonospora)多种可产抗生素，如棘孢小单胞菌(M.echinospora)产庆大霉素。放线菌之游动放线菌属（Actinoplanes）典型代表：济南游动放线菌(Actinoplanes

tsinanesisn)产创新霉素(creatmycin；1964)创新霉素分子结构

真菌之根霉属(Rhizopus)生产甾体激素、延胡索酸及酶制剂等。真菌之曲霉属(Aspergillus)生产枸橼酸、葡萄糖酸、有机酸类、抗生素，进行甾体转化。真菌之青霉属(Penicillum)产黄青霉(Penicillum

chrysogenum)

生产青霉素，也可用来生产葡萄糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏血酸真菌之头孢霉菌属(Cephalosporium)产黄头孢霉(Cephalosporium

chrysogen)、顶孢头孢霉菌(Cephalosporium

acremonium)

都生产头孢菌素C真菌之酵母菌属(Saccharomyces)啤酒酵母(Saccharomyces

cerevisiae)：生产啤酒、酒精、药用酵母等；核酸、麦角固醇、细胞色素C、凝血质和辅酶A等。红酵母(Rhodotorula)：β-胡萝卜素棉病针孢酵母(Nematspora

gossypii)：核黄素真菌之其它牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、胆碱和腐胺等生物碱。灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。二、制药微生物菌种的选育生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它类似代谢产物少操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯粹，遗传性状稳定、不易变异退化安全性：非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素发酵菌种的选育方法从自然界中获得新菌种诱变育种杂交育种原生质体融合基因工程从自然界中获得新菌种土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端环境等基本程序：采样预处理富集培养筛选鉴定野生型菌株诱变育种物理或化学方法诱发突变物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等杂交育种：借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换

原生质体融合育种：借助原生质融合技术实现遗传物质的交换

基因工程育种：DNA体外重组技术定向育种，技术含量高，应用面广三、制药微生物菌种的保藏

(Cultureconservation)目的：保证菌种经过较长时间后仍保持生活能力，防止被杂菌污染，形态特征和生理形状尽可能不发生变异。菌种保藏三要素典型菌种的优良纯种的休眠体；创造有利于种子休眠的环境（低温、干燥、缺氧、避光、缺少营养）；尽可能采用多种不同的手段保藏同一菌株。菌种保藏的常用方法斜面低温保藏法石蜡油封存法砂土管保藏法麸皮保藏法甘油悬液保藏法冷冻真空干燥保藏法液氮超低温保藏法宿主保藏法方法名称主要特点适用范围保藏期斜面低温保藏法传代培养，4℃保藏各种微生物的短期保藏。1-6个月石蜡油封存法石蜡油隔绝空气，室温或4℃保藏各种微生物的中短期保藏，不适用某些能分解烃类的菌种。1-2年砂土管保藏法沙土管作载体，干燥器中抽真空，室温或4℃保藏产孢子微生物和芽孢细菌的长期保藏，不适用对干燥敏感的微生物1-10年麸皮保藏法麸皮作载体，干燥，4℃保藏产孢子霉菌和某些放线菌，工厂多采用此法1年甘油悬液保藏法悬浮于10-15%甘油中，需低温冰箱基因工程菌1年/10年冷冻真空干燥保藏法用保护剂制备悬液，快速冻结，减压抽真空，需冻干机各类微生物5-15年液氮超低温保藏法保护剂，超低温（-196℃），需超低温液氮设备各类微生物15年以上宿主保藏法与培养基混合直接低温保存专性活细胞寄生微生物（如病毒）菌种保藏机构ＡＴＣＣ中国微生物菌种资源库ＣＣＣＣＭ中国微生物菌种保藏管理委员会ＮＣＴＣ国家标准菌库,全国典型菌种收集委员会四、微生物代谢产物的生物合成（一）微生物合成的初级代谢产物（二）微生物次级代谢产物的生物合成基本特征：1、次级代谢产物具有种特异性2、分批发酵时，产生菌生长周期分为三个时期：菌体生长期、产物合成期以及菌体自溶期3、次级代谢产物不少是结构相似的混合物4、次级代谢产物的合成受多基因控制第三节发酵工艺条件的确定发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备发酵设备——发酵罐发酵罐的特点轴封严密，泄漏少能承受一定压力、温度搅拌通风装置保证气液充分混合具有足够的冷却面积死角少，灭菌彻底适宜的径高比（高与直径的比值为2.5—4）发酵罐的类型搅拌釜反应器鼓泡式反应器气升式反应器发酵辅助设备无菌空气系统无菌空气的要求灭菌系统、管道、阀门培养基及其灭菌培养基（medium）培养基的成分碳源、氮源、无机盐和微量元素、水、前体物、促进剂、抑制剂培养基的类型合成培养基（用于科学研究）复合培养基（用于工业生产）固体培养基液体培养基半固体培养基按组成按形态按用途孢子培养基种子培养基发酵培养基影响培养基质量的因素原材料质量的影响水质的影响灭菌的影响pH的影响其他影响因素灭菌操作技术工业生产中常用的灭菌方法：化学物质灭菌辐射灭菌过滤介质除菌热灭菌：包括干热灭菌和湿热灭菌培养基和发酵设备的灭菌方法：实罐灭菌（实消）空罐灭菌（空消）连续灭菌（连消）过滤器及管道灭菌无菌检查与染菌处理无菌检查：无菌试验、发酵液直接镜检和发酵液生化分析染菌的判断：以无菌试验中的酚红肉汤培养基和双碟培养的反应为主，以镜检为辅。染菌防治技术：污染杂菌污染噬菌体微生物发酵方式分批发酵补料分批发酵半连续发酵连续发酵发酵过程中的主要参数及控制市场部：当前发酵过程控制的技术进展。技术部：确定pH、温度、溶氧、补料等关键参数的控制方法，撰写操作规程。品控部：制定发酵过程控制的方案。总经理：协调监督各部工作，最后拿出完整的计划书。发酵过程工艺控制参数一物理参数1温度2压力：内部压力高于外部压力。3搅拌转速：转/分钟4搅拌功率：每立方米发酵液所消耗的功率，kw/m35空气流量：每分钟内每单位体积发酵液通入空气的体积，V/V.min6粘度：反映氧传递阻力和菌体浓度。二化学参数1pH2基质浓度：糖、氮、磷等。3溶解氧浓度4氧化还原电位5产物浓度6废气中氧的含量7废气中CO2的含量。三生物参数1菌体浓度2菌丝形态发酵过程中的代谢变化一初级代谢产物发酵的代谢变化1菌体浓度的变化延迟期、对数生长期、静止期和死亡期。延迟期的长短与培养条件和菌种生理状态有关。在未达死亡期之前放罐。2营养基质浓度的变化随发酵时间的延长不断降低，用于菌体的生长和产物的形成。溶氧的变化规律(后面讲)。3产物浓度的变化

(1)与菌体浓度平行；

(2)与培养条件有关。二次级代谢产物发酵的代谢变化次级代谢发酵的菌体生长(生长期)和产物合成期(生产期)是分开的。发酵过程可分为：菌体生长、产物合成、菌体自溶三个阶段。1菌体生长阶段

(1)营养成分的变化碳源、氮源和磷酸盐等营养物质不断被消耗，浓度明显减少，而新菌体不断合成，菌浓明显增加。(2)摄氧率的变化随菌浓增加，摄氧率不断增加，溶氧浓度下降，菌浓至临界，溶氧至最低。(3)pH

先下降后下升：利用葡萄糖产生酸，而后再被利用。先上升后下降：利用氨基酸的碳骨架，剩下氨，而后氨又被利用。限制性因素的出现，使菌体由生长向生产转化。2产物合成阶段产物产量不断增多，起至达到最大值，生产速率也达最大，直至产物合成能力衰退。该阶段要严格控制发酵条件，对产物的合成最为关键。例如营养浓度。3菌体自溶阶段菌体衰老、开始自溶，氨氮含量升高，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率下降。此时结束发酵。发酵过程的影响因素及控制菌体浓度营养物质温度pH溶氧泡沫染菌发酵终点的判断菌体浓度：单位体积培养液中菌体的含量。影响菌体生长的因素在适合的生长速率下，发酵产物的产率与菌体浓度成正比关系。特别是初级代谢产物。菌体浓度过低，产物产率下降。菌体浓度过高，产生其他影响。措施：调节培养基中的营养物质的浓度。菌体浓度影响及其控制营养物质碳源氮源磷酸盐补料：半饥饿状态基质对发酵的影响及补料的控制碳源的影响及其控制1、碳源的种类影响代谢情况迅速利用的碳源：迅速参与代谢，合成菌体和产生能量，并产生分解产物，因此有利于菌体生长，但对产物(特别是次级代谢)有抑制作用(例如葡萄糖)。缓慢利用的碳源：可被菌体缓慢利用，有利于延长代谢产物的合成，特别有利于抗生素分泌期的延长(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、饴糖等)。机理解释：乳糖的利用速度刚好符合青霉素的合成速度。控制方法：流加葡萄糖或采用混合碳源。2、碳源浓度的影响

浓度合适。控制方法：中间补料。氮源的影响和控制1、氮源浓度的影响以谷氨酸发酵为例：NH4+太高：合成谷氨酰胺；NH4+不足：积累α-酮戊二酸。2、氮源的种类的影响速效氮源：氨基态氮和玉米浆，促进菌体生长，但对部分产物，特别是次级产物合成有抑制作用。缓慢氮源：需要经过微生物胞酶的消化才能释放出氨基酸或NH4+，如黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等，延长产物合成期。发酵培养基一般采用速效与缓慢氮源的混合物，且发酵过程中间还要补加氮源以控制其浓度。如氨基酸发酵用铵盐（硫酸铵或醋酸铵）和黄豆饼粉水解物；链霉素发酵采用硫酸铵和黄豆饼粉补加有机氮源：如土霉素发酵，补加玉米浆青霉素发酵，补加尿素(2)补加无机氮源(补氮和调pH双重功效)

补加氨水或硫酸铵是工业上常用的方法如pH偏高又需补氮时加硫酸铵磷酸盐的影响和控制适合微生物生长的磷盐浓度偏高0.3～300mmol；适合次级代谢产物合成的磷盐浓度偏低，平均仅为1.0mmol，提高到100mmol就明显抑制其合成。对抗生素发酵，一般采用亚适量。温度对发酵的影响及其控制影响发酵温度变化的因素产热：生物热和搅拌热散热：蒸发热、辐射热和湿热温度的变化对发酵过程的影响1、影响酶反应的速率和蛋白质的性质菌体生长所需温度与产物合成温度不一致(如青霉素)；温度不同还可能影响产物合成的方向(如金霉素和四环素)。2、影响发酵液的物理性质，如温度下降氧在发酵液中溶解度升高粘度、氧和基质的溶解与传递、分解和吸收最适发酵温度是指既适合菌体的生长，又适合代谢产物合成的温度。如乳酸的发酵，乳酸链球菌最适生长温度34℃，产酸最多的温度30℃变温发酵如青霉素发酵30℃→25℃→2℃→25℃pH对发酵的影响及其控制影响发酵液pH变化的主要因素：菌种遗传特性、培养基的成分和培养条件如灰黄霉素发酵，乳糖为碳源pH维持在6.0～7.0

葡萄糖为碳源pH下降到3.6，发酵单位很低pH对发酵的影响及其控制一、

pH对发酵的影响1、影响微生物的生长及产物的合成(通过影响酶活性实现)；生长最适pH与合成最适pH不一致菌体内的pH近中性，因为发酵培养基中的pH是通过间接方式作用与胞内酶的2、影响菌体对基质的利用速度和细胞结构(通过影响膜实现)；例如产黄青霉在低pH下为丝状，高pH为酵母状3、影响产物的稳定性；噻呐霉素在pH6.7-7.5时稳定；青霉素在碱性条件下发酵产量低二、发酵pH的变化(影响因素)1、菌种的遗传特性菌种具有自我调节pH能力，但能力有限度(地中海卡诺氏菌发酵生产利福霉素SV)2、营养成分的分解代谢碳源分解代谢产生中间产物丙酮酸，产生丙酮酸的多少与碳源种类和浓度有关。

pH变化是菌体产酸或产碱的综合作用结果，可能通过pH变化反应发酵情况。如灰黄霉素发酵，乳糖为碳源pH维持在6.0～7.0

葡萄糖为碳源pH下降到3.6，发酵单位很低三、发酵pH的确定和控制1、发酵pH的确定根据实验结果确定2、pH控制最适pH在微生物生长和产物形成相互关系：

(1)二者的pH相似且在较宽的内；

(2)生长的pH较宽，而合成的pH较窄；

(3)二者都敏感，但最适点相同；

(4)二者都敏感，但最适点不同。pH的控制方法：1、培养基配比适当，使pH在合适的范围内变化；2、直接补加酸碱或补料；其中采用补料的方法可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH和改变培养基性质等几种目的。补加酸或碱和补料的方式pH和氨氮含量都低时补加氨水pH较高氨氮含量又低时补加硫酸铵溶氧对发酵的影响及其控制溶氧对发酵的影响菌体生长、产物合成以及产物的性质1、有时，氧充分促进产物合成，如谷氨酸和金霉素发酵；2、有时，氧充足会对产物有抑制作用，如维生素B12发酵。

因此溶氧并非越高越好。氨基酸发酵对氧的需求分三类：1谷氨酸、精氨酸和脯氨酸，氧必须供应充足，产量才大；2异亮氨酸、赖氨酸和苏氨酸，供氧充分可获得最高产量，但供氧受限时，不会有太大影响；3亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸，供氧受限对产物合成有利。发酵过程中的溶氧变化在一定的发酵条件下，每种产物发酵的溶