第二章 代谢调节3

酶含量的调节

（主要通过基因表达调控来影响蛋白质含量）基因表达（geneexpression）特定核苷酸序列的转录和翻译。原核生物：基因组结构简单，转录和翻译是在同一时空进行。真核生物：基因组结构复杂，转录和翻译在时间和空间上均被隔开。2.1酶蛋白的合成

大肠杆菌（E.coli）基因组约含4300个基因，只有5％高水平表达；人类基因组约含3.0万个基因，只有2％高水平表达。其中有些基因在各种细胞内是以恒定水平表达的，这些基因被称为管家基因。以恒定水平表达的方式，被称为组成性表达。

(如β-actin,G3PD)

可诱导基因：

这些基因需在特定环境信号刺激下才能表达，被称为可诱导基因。能增强基因表达的物质，称为诱导剂（inducer）。

可阻遏基因

另有一些基因在特定环境信号刺激下，表达水平下降，称为可阻遏基因。

能阻抑基因表达的物质，称为阻遏剂(repressor)。操纵子（operon）

是由功能上相关联的多个编码序列（结构基因）及其上游的调控序列串联在一起构成的一个转录协调单位。2.1.1原核生物基因表达的调控（转录水平）JacobandMonod(1961)Regulatorygenepromoter

operator

structuralgenes

ABC

CAPsiteIPORNA聚合酶附着部位阻遏蛋白cAMP-CAP结合部位阻遏蛋白受体部位

operon

调控序列

编码序列多顺反子mRNA

转录翻译

A、B、C3个蛋白质操纵子操纵序列启动序列CAP位点调节基因调控序列编码序列（结构基因）多顺反子mRNA：

功能上相关联的多个结构基因串联在一起、被转录成一个mRNA、翻译成多种蛋白质，这种mRNA被称为多顺反子mRNA。——阻遏蛋白受体部位——RNA聚合酶附着部位——cAMP-CAP结合位点——表达阻遏蛋白——表达酶蛋白

2.1.1.1诱导剂诱导酶蛋白合成的机理（基因表达与培养液中存在的碳源有关）（1）

培养液中存在高浓度Glc,或Glc

和Lac同时存在时，

E.coli优先利用葡萄糖——“葡萄糖效应”；

可以通过阻遏蛋白的负性调控，使Lac操纵子结构基因关闭；（2）Glc被耗尽，或存在高浓度Lac时，

可以通过乳糖（别乳糖）诱导，使基因开启；并需要CAP-cAMP的正性调控。培养液：

存在高浓度Glc,或Glc和Lac同时存在时，E.coli不利用Lac.，乳糖操纵子结构基因关闭。培养液：Glc被耗尽，或只存在高浓度Lac时，E.coli

利用

Lac.，乳糖操纵子结构基因开启、表达。乳糖→别乳糖→作为诱导剂，使阻遏蛋白变构失活→不能与操纵序列结合→RNA聚合酶发挥作用，催化结构基因转录。实验室常用IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）作为诱导剂

乳糖/别乳糖是一种弱诱导剂，诱导能力有限，需要CAP的增强作用。即需要“Lac诱导＋CAP的正性调控”

CAP是别构蛋白，需要被cAMP结合形成活性复合物，才能发挥正性调控作用。无Glc时cAMP的水平受培养液中葡萄糖浓度的影响PDEGlucoseAC→cAMP水平↑→CAP-cAMP

与CAP位点结合

（出现Glc效应的原因）高浓度GlcGlc耗尽后不能实现CAP-cAMP的正性调控→cAMP水平→不能激活CAP激活PDE抑制AC→分解代谢产物启动Lac的诱导作用PDE↓、AC↑促进RNApolⅡ活性

增强基因转录活性

Lac操纵子基因转录的调控（要点）（1）受阻遏蛋白的负性调控和CAP的正性调控的协调作用，控制基因转录速率；（2）在Glc和Lac都存在时，优先利用Glc,通过阻遏蛋白的负性调控，关闭基因；（3）Glc耗尽后，乳糖/别乳糖作为诱导剂，并通过

cAMP-CAP正性调控，促使基因转录。

2.1.1.2阻遏剂阻抑酶蛋白合成的机理调节基因表达无活性的阻遏蛋白，不能与操纵序列结合，RNA聚合酶催化基因转录，基因呈开放状态。色氨酸作为辅阻遏物，与阻遏蛋白形成有活性的辅阻遏物－阻遏蛋白复合物。后者与操纵序列结合阻止RNA聚合酶移动，基因关闭。

色氨酸操纵子（Trp

operon）ROtrpRPtrpEtrpDtrpCtrpBtrpA结构基因

调控区trpE

基因5´端的转录产物有一段约162bp长度的前导序列。前导序列中含有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4个互补的短序列。Ⅲ与Ⅳ序列互补，可形成衰减子（attenuator）结构。

在高浓度色氨酸存在下，通过形成特殊的“衰减子”结构，对转录进行更加精细的负性调控。

162bp在序列Ⅰ中，第10、11位有两个Trp密码子。“衰减子”结构的形成与序列Ⅰ中的两个Trp密码子有关。

色氨酸操纵子的“衰减子”调控

“衰减”控制是原核生物普遍存在的精细而灵敏的转录调控机制2.1.2真核生物的基因表达调控1）基因表达在细胞核和胞质不同时空中进行2）真核生物基因组结构复杂（有如下特点）（1）基因组结构庞大

3X109bp,约含3.0万个基因,95％为非编码区（2）由DNA、组蛋白和酸性蛋白形成超螺旋管的染色体结构而存在（3）含大量重复序列（高度/中度/反向重复序列）

（4）结构基因为单拷贝序列,单顺反子转录（5）断裂基因（内含子、外显子间隔排列）染色体的组装断裂基因（splitegene）3）基因自身结构的改变

基因丢失基因扩增基因重排

DNA甲基化修饰(形成5M-CpG，使基因沉默)4）多环节调控

（1）基因活化

（2）转录水平

转录起始、转录后加工、转录产物的转运

（3）翻译水平

翻译后加工、靶向运输

CpG岛的甲基化修饰，使基因沉默

2.1.2.1真核基因转录水平上的调控

其中由DNA和组蛋白构成核小体,作为染色体的基本单位。2.1.2.1.1组蛋白与非组蛋白

DNA真核生物染色体主要由三大类成分

组蛋白（富含Arg、Lys）非组蛋白（酸性蛋白）

DNA真核生物染色体主要由三大类成分

组蛋白（富含Arg、Lys）非组蛋白（酸性蛋白）由组蛋白H2A、H2B、H3和H4各2分子组成八聚体为核心，外绕1¾圈DNA双链（146bp）,构成核小体，核小体之间含1个H1组蛋白，由一条DNA链串连起来形成念珠样结构。组蛋白——呈碱性，对DNA

转录有阻抑作用：非组蛋白——一类转录调控蛋白，参与转录调控

核小体组成H1H1组蛋白H2A、H2B、H3和H4的肽链N末端尾,特定位点上的氨基酸残基（如Lys/K）可发生酶促共价修饰：

如乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化等，参与调节基因转录活性。目前已发现有100多个位点发生了共价修饰，对基因转录起到激活或抑制作用。已有30多种特异的组蛋白修饰抗体可供试验。研究发现：组蛋白乙酰化修饰，促进基因转录；组蛋白去乙酰化，使基因沉默。目前研究发现，基因启动子部位CpG岛的DNA甲基化、组蛋白乙酰化与去乙酰化，被认为是表观遗传修饰的主要分子机制。在各种修饰物的综合作用下，调节基因转录活性。2.1.2.1.2RNA聚合酶Ⅱ及转录起始因子

真核生物RNA聚合酶（三类）RNApolⅠ——催化合成45SrRNA前体分子；再加工为28S、18S和5.8SrRNA；RNApolⅢ——主要负责催化5SRNA、tRNA和7SRNA等小分子RNA的转录；RNApol

Ⅱ——催化几乎所有编码蛋白质的结构基因转录，先转录生成hnRNA，再加工为mRNA。

RNApol

的作用需一大类转录因子的协助（1）与RNApolⅡ对应的转录因子为TFⅡ类

（2）TFⅡ类转录因子有A、B、D、E、F、H、J等多种亚型（3）转录启动前，TFⅡD与RNApolⅡ及其他TFⅡ类转录因子按一定时空顺序结合先形成PIC。

（已知TFⅡ类转录因子参与几乎所有转录过程，

又被称为通用转录因子

转录前起始复合物（PIC）的形成2.1.2.1.3顺式作用元件（cis-actingelements）

是指真核生物基因组中参与调控自身DNA链内结构基因转录活性的特异碱基序列(调控序列)

。启动子（promoter）增强子(enhancer)沉默子(silencer)GGGCGGTATAATCAAT-60100bp-4060bp

-2530bp

启动子

结构基因编码链（＋）模板链（-）5'转录起始点

（＋1）

增强子3'根据顺式作用元件的作用和位置又有

35（1）启动子

位于转录起始点上游，能被RNApolⅡ识别、结合，启动转录的一段碱基序列。常有特殊的共有序列：

（2）增强子是增强启动子转录活性的特异碱基序列。

（远离转录起始点，位置灵活，其作用与方向、距离无关）（3）沉默子

对基因转录起阻遏作用的特异碱基序列，属于负性调控元件。共有碱基序列——TATA盒、GC盒、CAAT盒等TATA盒（核心序列）——是TFⅡD和RNAPolⅡ结合位点

34①

启动子作用前，需要与通用转录因子、RNApolⅡ结合外，还需其他多种调节蛋白的参与。②

增强子必须与特异调节蛋白结合后，才能发挥转录增强作用。根据作用性质，又分：順式作用元件都必须与相应调节蛋白结合后，才能发挥转录调节作用。注意：组织特异性增强子——受特异调节蛋白调节诱导性增强子——受激素或细胞因子诱导而产生的调节蛋白③沉默子的负性调控，也必须与特异调节蛋白结合后才能发挥调节作用。

顺式作用元件（启动子、增强子、沉默子的调控作用，均需相应的转录调节蛋白的参与。）CAAT盒GC盒TAAT盒（＋1

）

promoter2.1.2.1.4反式作用因子（trans-actingfactor）能直接或间接与顺式作用元件相互作用，进而调控特异基因转录的一类调节蛋白,或称转录调节蛋白、转录因子

（transcriptionfactor,TF）。

按其功能不同，常分以下两大类：

基本转录因子

特异转录因子转录抑制因子——与沉默子结合转录激活因子——与增强子结合——指参与形成PIC的TFⅡ类调节蛋白

DNA结合域（DNAbindingdomain,DBD）转录激活域（activatingdomain,AD）锌指（zincfinger）结构DNA结合域(DBD)

亮氨酸拉链（Leuzipper）结构螺旋－转角－螺旋（helix-turn-helix,HTH）转录激活域（AD）——控制转录起始复合物的形成,并激活转录活性(富含酸性aa区、Gln区和Pro区)转录因子两个重要的功能结构域

形成同源或异源二聚体，增强与DNA结合力。常有两个或两个以上锌指结构，利于插入DNA双螺旋的深沟并与之结合锌指结构亮氨酸拉链结构LDL-R基因的表达，需要TFII类转录因子、RNAPolII、多种转录因子的协同作用2.1.2.1.5反义RNA(antisenseRNA)MizunoandSimons(1983年)发现:

能够通过碱基互补与细胞内同源mRNA（为正义RNA）结合，从而抑制mRNA翻译为蛋白质的RNA，称反义RNA。1995年复旦大学Shu

Guo博士在美国康奈尔大学实验：结果：两组线虫体内的par-1基因表达均被抑制反义RNA注入线虫体内→以阻断par-1基因表达正义RNA注入线虫体内（作对照）→期待观察到增强效果华盛顿卡内基研究院FireA博士注意到，Guo博士研究结果已经不能单用反义RNA技术来解释了，推测可能还有其它的成分参与了这一过程。纯化的反义RNA纯化的正义RNAdsRNA杂合体分别注入线虫体内

对同源mRNA表达

有弱的抑制作用

有强烈抑制作用实验结果证实dsRNA具有强烈的阻抑基因表达的作用

FireA将dsRNA对同源mRNA表达的阻断作用称之为RNA干扰（RNAinterference,RNAi）。

1998年，Fire将实验结果公布于Nature杂志。2006年，FierAandMelloC两人因发现RNA干扰机制同获诺贝尔生理学医学奖安德鲁·法尔克雷格·梅洛参与RNAi机制幷发挥重要作用的酶蛋白

Dicer酶（特殊的RNA酶）：

将dsRNA降解成21－25个核苷酸长度的片段，后者称为siRNA(smallinterferenceRNA)。

RISC复合物（RNA-inducedsilencingcomplex）（RISC是一种核蛋白复合物，具有螺旋酶、核酸外切酶、核酸内切酶和同源搜索区等多功能酶活性）作用：降解同源mRNA

miRNP(微小核糖核蛋白，microRNAprotein)对mRNA的翻译进行抑制作用。

RNAi机制（基本过程）

RNAi技术的应用1）研究基因功能尤其可以将RNAi与基因组学研究结合起来，对特异基因进行筛选，确认特异基因的功能。目前已有报道利用RNAi技术确认了磷脂酰肌醇激酶和细胞核因子－кB的信号传导通路的基因。2）已发现生物体内有数百种(microRNAs)

miRNA参与调控基因表达，参与细胞生长、发育、分化、免疫应答等调控。3）用于疾病的治疗

体外合成dsRNA,

利用RNA干扰技术对抗多种病毒感染：如抗免疫缺陷病毒（HIV）、SAS病毒等，用于在易感细胞中防治感染产物的生成。也用于对抗特殊的癌症基因：如黑色素瘤、胰腺癌、白血病等。还包括心脑血管性疾病、神经退行性变等。

RNAi技术是近几年兴起的非常有效、特异性很高的转录后基因沉默技术。

RNAi技术不仅在基础研究领域中被广泛运用，在临床研究中，如抗病毒、抗肿瘤、药物筛选等，也正在被广泛采用。RNAi和miRNA孕含着巨大的科学价值和应用前景。其他临床或临床前试验：

Quark制药公司，研制靶标是TP53基因的siRNA，用于治疗急性肾衰竭Alnylam制药公司联合其他公司，正在研制治疗高胆固醇血症、亨廷顿舞蹈病、丙型肝炎病毒、流感等的siRNA。2.1.2.1.6RNA加工剪接

mRNA——5‘加“帽”、3’加“尾”，甲基化修饰，剪接

tRNA——形成反密码环、加上3'－CCAOH末端，碱基修饰

rRNA——剪裁，与蛋白质组装成“核糖体”复合物2.1.2.2翻译水平的调控

（1）翻译前调节mRNA的稳定性（2）选择性翻译mRNA

（3）调节翻译的起始（4）翻译后加工eIF-2eIF-2-p(失活)eIF-2k血红素（－）Met-tRNA

40S小亚基

mRNA60S大亚基起始复合物→启动翻译（珠蛋白链）