样品离子化研究

样品离子化研究主讲人：付建武江西中医学院研究生部质谱(MS)法常用的离子化方式：基本原理是将供试物分子经一定离子化方式，如电子轰击或其它离子化方式，一般是把分子中的电子打掉一成为M+，继之裂解成一系列碎片离子，再通过磁场使不同质荷比(m/z)的正离子分离并记录其相对强度，绘出MS图。即可进行元素分析、分子量测定、分子式确定和分子结构的解析和推断等等。离子源的作用是接受样品产生离子，常用的离子化方式有：电子轰击离子化（electronimpactionization，EI）、化学离子化(ChemicalIonization,CI)、场致离子化(FieldIonization,FI)、场解吸离子化(FieldDesorptionIonization,FD)、负离子化学离子化(NegativeIonCI,NICI)、快原子轰击(FastAtomicBombardment,FAB)、激光解吸(LaserDesorptionInoization,LD)等等。质谱法常用的离子化方式质谱有多种电离方法，每一种电离方法都有一定的分子量检测范围，一般认为热喷雾的分子量检测最大范围约8ku，快原子轰击为25ku。但是随着分子质量的增加，所有分析方法的灵敏度均有所下降。离子源将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。离子源是质谱仪的心脏，可以看作是比较高级的反应器，样品在其中发生一系列的特征降解反应，分解作用在很短时间（～1μs）内发生，所以可以快速获得质谱。软电离方法能量的较低电离方法适用于易破裂或易电离样品

不同分子离子化所需要的能量差异很大，应选择不同的离解方法。硬电离方法能量较高的电离方法各种离子源的基本特征电子轰击源(ElectronIonization,EI)++++:R1:R2:R3:R4:e+M+(M-R2)+(M-R3)+MassSpectrum(M-R1)+用高能电子束从试样分子中撞出一个电子而产生正离子（M＋e→M+＋2e）以及碎片离子。M为待测分子，M+为分子离子或母离子。碎片离子指分子中某些化学键断裂而产生的质量较小的带正电荷的碎片。大多数质谱法只研究正离子，EI源：可变的离子化能量

(10~240eV)

对于易电离的物质降低电子能量，而对于难电离的物质则加大电子能量（常用70eV）。电子能量电子能量分子离子增加碎片离子增加EI离子源的产生过程：使有机分子被一束电子流（能量一般为70eV）轰击，失去一个外层电子，形成带正电荷的分子离子（M+），M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基，在电场作用下，正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。电子轰击离子化可使分子引起相当大的碎裂，所得分子离子峰往往并不很强甚至不能识别。分子较大碎裂对供试药物的鉴定和结构解析是十分有利的；但对混合组分的分析和药物纯度检查是不利的。电子轰击离子源装置原理在此装置中，由阴极发射出的电子经加速后在飞向阳极过程中，与由进样器输入的样品分子碰撞而引起电离。所产生的离子由静电透镜引出电离室，经加速、聚焦成一定能量和强度的离子束，通过出口狭缝进入质量分析器。电离室通常保持一定的真空度和温度。阴极发射的电子数通过调节阴极灯丝温度加以控制，而电子的能量则通过控制两极上的外加电压来调整。静电场通常保持在6-100V范围内。其特点是能得到较强而稳定的离子流，但要求样品只能是气态的原子或分子。EI源的特点：

应用最广，标准质谱图基本都是采用EI源得到的；电离效率高，能量分散小，结构简单，操作方便。图谱具有特征性，化合物分子碎裂大，能提供较多信息，对化合物的鉴别和结构解析十分有利。所得分子离子峰不强，有时不能识别。本法不适合于高分子量和热不稳定的化合物。缺点：质谱图中分子离子峰很弱或不出现（由于电子的能量高，分子离子进一步离解成碎片离子）电子轰击电离的灵敏度和分辨率一定能量的电子直接作用于样品分子，使其电离，且效率高，有助于质谱仪获得高灵敏度和高分辨率。有机化合物电离能为10eV左右，50-100eV时，大多数分子电离界面最大。70eV能量时，得到丰富的指纹图谱，灵敏度接近最大。适当降低电离能，可得到较强的分子离子信号，某些情况有助于定性。质谱中提供的重要信息之一是获得样品的相对分子质量。化学电离源是采用较温和的、通过离子—分子反应进行的化学电离法。化学电离法就是用高能电子（100~240eV）轰击离子室内的反应气（甲烷、甲烷、异丁烷、氨气等；10~100Pa，样品的103~105倍，避免样品与电子碰撞），甲烷分子先被电离，形成一次、二次离子，

化学电离源（ChemicalIonization，CI）++气体分子试样分子+准分子离子电子(M+1)+;(M+17)+;(M+29)+;这些离子再与样品分子发生反应，形成比样品分子大一个质量数的（M+1）离子，或称为准分子离子。准分子离子也可能失去一个H2，形成（M-1）离子。化学电离源的特点准分子离子峰强；不会发生象EI中那么强的能量交换，较少发生化学键断裂，谱形简单。；不适用难挥发试样；不会发生象EI中那么强的能量交换，较少发生化学键断裂，谱形简单。分子离子峰弱，但（M+1）峰强，这提供了分子量信息。电子轰击的缺陷是分子离子信号变得很弱，甚至检测不到。化学电离引入大量气体试剂，使样品分子与电离离子不直接作用，利用活性反应离子实现电离，其反应热效应可能较低，使分子离子的碎裂少于电子轰击电离。商用质谱仪一般采用组合EI/CI离子源。试剂气一般采用甲烷气，也有N2,CO,Ar或混合气等。试剂气的分压不同会使反应离子的强度发生变化，所以一般源压为0.5-1.0Torr。场致电离源（fieldionization,FI）应用强电场诱发样品电离（量子隧道效应）电压：7-10kV；d<1mm；强电场将分子中拉出一个电子，电离后被阳极排斥出离子室并加速经过狭缝进人质量分析器。阳极+++++++++++++阴极d<1mm场离子化是一种温和的技术，产生的碎片很少。主要为分子离子和（M＋l）离子。碎片通常是由热分解或电极附近的分子一离子碰撞反应所产生。在结构分析中，往往最好同时获得场离子化源或化学离解源产生的质谱图和用电子轰击源的质谱图，而获得相对分子质量及分子结构的信息。

场致离子化的特点非常适用于易变分子的离子化，如碳水化合物、氨基酸、多肽、抗生素和苯丙胺类药物均宜采用；此法也能产生较强的分子离子峰和准分子离子峰。分子离子峰强；碎片离子峰少；不适合化合物结构鉴定；当样品蒸汽邻近或接触带高的正电位的金属针时，由于高曲率半径的针端处产生很强的电位梯度，样品分子可被电离，这称为场电离。场电离要求样品分子处于气态，灵敏度又低，因而应用逐渐减少。场解吸的原理与场电离相同，但样品是被沉积在电极上。为增加离子的产率，电极上有很多微针（microneedles）。在电场的作用下（或再辅以温和地加热），样品分子不经汽化而直接得到准分子离子，因而场解吸适合于难汽化的、热不稳定的样品，如肽类化合物、糖、高聚物、有机酸的盐、有机金属化合物等。

场解吸离子化(FieldDesorptionIonization,FD)由场解吸所得的质谱中准分子离子峰强，碎片离子很少，为得到较多的结构信息需进行碰撞导断裂（collisioninduceddissociation,CID）。场解吸离子化扩大了MS的使用范围，此法可用于极性大、难气化以及对热不稳定的化合物，因而在生物活性组分、药物及其代谢产物或分解产物的研究分析工作中是一种非常重要而且十分有效的分析工具。负离子化学离子化(NegativeIonCI,NICI)负离子化学离子化(NegativeIonCI,NICI)：是在正离子MS的基础上发展起来的一种离子化方法，其给出特征的负离子峰，具有很高的灵敏度（10-15g）。只要供试药物本身或通过衍生化后具有高电子亲合能力者，就可选用此法，而且可给出特征的负离子峰。快原子轰击(FastAtomicBombardment,FAB）

快原子轰击质谱技术（FastAtomBomebard-mentMassSpectrometry,FABMS）是一种软电离技术，是将样品溶解于低挥发性的液体基质中，用高速的中性粒子，如氩、氙等原子来轰击存在于底物中的样品，使样品离子溅出进入分析器而解吸，因之称为快原子轰击离子化。这种软电离技术适于极性强、热不稳定的化合物的分析，特加适用于多肽和蛋白质等的分析研究。FABMS只能提供有关离子的精确质量，从而可以确定样品的元素组成和分子式。而FABMS－MS串联技术的应用可以提供样品较为详细的分子结构信息，从而使其在生物医学分析中迅速发展起来。快原子轰击是80年代以来，被广为利用的一种软电离技术。快原子轰击是利用重的原子如Ar、Xe，将其电离后再加速成为具有较大动能的快速离子，然后在原子枪内进行电荷交换反应，快速离子与静止的中原子发生碰撞并进行离子交换，形成中快速原子。原子枪中有一偏转电极，使未发生碰撞的快速离子被偏转引出，快速原子则打在靶上。当快速原子打在含有样品的基质时，部分能量能导柱品的蒸发及解离，然后被送入分析系统被测量。常用的基质有甘油、硫代甘油、3-硝基苄醇等，所选择的基质应具有流动、低蒸汽压、化学惰、电解质和好的溶解能力。FAB适用于对热不稳定、难挥发、高极的有机化合物，如氨基酸、多肽、糖类等。

快原子轰击质谱技术的特点：可直接进行分析，毋需做成衍生物；可适用于较大分子的MS分析，而EI、CI、FI、FD等方法只能用于中、小分子有机化合物的测定。如将FABMS与HPLC联用将成为适应力强的分析手段之一。大气压化学电离（APCI）

大气压化学电离（APCI）：在大气压下，化学电离反应速率更大，效率更高，能够产生丰富的离子。通过一定手段将大气压力下产生的离子转移至高真空处（质量分析器中）。早期为Ni63辐射电离离子源，另一种设计是电晕放电电离，允许载气流速达9L/S。需要采取减少源壁吸附和溶剂分子干扰。

API是主要应用于HPLC和质谱联用时的电离方法。它包括ESI和APCI，两者都是很软的电离方法，易于得到样品的分子量。通过对电压的调节，可以得到不同断裂程度的质谱大气压电离是由ESI衍生出来的方法。样品溶液仍由具有雾化气套管的毛细管端流出，被氮气流雾化，通过加热管时被汽化。在加热管端进行电晕放电使溶剂分子被电离形成反应离子，这些反应离子与样品分子发生离子－分子反应生成样品的准分子离子。与经典CI不同的，是APCI无须加热样品使之汽化，因而应用范围更广。由于要求样品分子汽化，因而APCI主要用于弱极的小分子化合物的分析。二次离子质谱（FAB/LSIMS）二次离子质谱（FAB/LSIMS）在材料分析上，人们利用高能量初级粒子轰击表面（涂有样品的金属钯），再对由此产生的二次离子进行质谱分析。主要有快原子轰击（FAB）和液体二次离子质谱（LSIMS）两种电离技术,分别采用原子束和离子束作为高能量初级粒子。一般采用液体基质负载样品（如甘油、硫甘油、间硝基苄醇、二乙醇胺、三乙醇胺或一定比例混合基质等）。主要原理是分子质子化形成MH离子，其中有些反应会形成干扰。等离子解析质谱（PDMS）等离子解析质谱（PDMS）采用放射性同位素（如Cf252）的核裂变碎片作为初级粒子轰击样品，将金属箔（铝或镍）涂上样品从背面轰击，传递能量使样品解析电离。电离能大大高于FAB/LSIMS，可分析多肽和蛋白质。激光解吸/电离（MALDI）激光解吸/电离（MALDI）是在波长为1250-775的真空紫外光辐射产生光致电离和解吸作用，获得分子离子和有结构信息的碎片，适于结构复杂、不易气化的大分子，并引入辅助基质减少过分碎裂。一般采用固体基质，基质样品比为10000/1。根据分析目的不同使用不同的基质和波长。是新近发展起来的一种有效离子化技术，能量高、指向性强，因此具有其它能源难以达到的离子化成效，可获得很强的准分子离子峰。在MS分析中，究竟选用哪一种离子化方式，主要取决于供试物的稳定性和挥发度。基质辅助激光解析电离（MALDI）基质辅助激光解析电离（MALDI）MALDI的工作原理是用小分子有机物作基质，将样品溶液和基质混合均匀，干燥成为晶体或半晶体后送入离子源内。用一定波长的脉冲式激光照射，基质分子能有效地吸收激光能量，瞬间由固态转化为气态，基质离子与样品相互碰撞使样品离子化，而得以进行质谱分析。常用的基质分子有2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸、烟酸、2-氰基,4-羟基肉桂酸等。MALDI特点是准分子离子峰很强，碎片离子峰很少，能直接测定难于电离的样品，特别是生物大分子物质如多肽、核酸、蛋白等。电喷雾电离（ESI）电喷雾电离（ESI）：采用强静电场（3-5KV），形成高度荷电雾状小液滴，经过反复的溶剂挥发-液滴裂分后，产生单个多电荷离子，电离过程中，产生多重质子化离子。电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同，电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成，而且多肽离子带有多个电荷，由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物，在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时，喷射成雾状的细小液滴，这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后，多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer)连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子，并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后，依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子(ionspectrum)，通过数据库检索，由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且，氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索，也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。ESI的工作原理是样品溶液从具有雾化气套管的毛细管端流出时在电场和雾化气（通常是氮气）的吹带作用下喷成无数的带电微液滴，在一定加热温度下，液滴中的溶剂被快速蒸发，液滴直径不断变小，表面电荷密度不断增大。最终使溶剂和样品离子从液滴中被排挤出，样品离子进入分析器被检测。产生的样品离子可能具有单电荷或多电荷，这和样品分子中的酸和碱基团数量有关。通常小分子样品得到带单电荷的准分子离子；大分子样品则得到多种多电荷离子。ESI电离是很软的电离方法，通常没有碎片离子峰，只有整体分子的峰。有利于生物大分子的测定。

电喷雾质谱技术与气相的联用技术电喷雾质谱技术是在毛细管的出口处施加一高电压，所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴，随着溶剂蒸发，液滴表面的电荷强度逐渐增大，最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子，致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子，使质量电荷比（m/z）降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而大大扩展了分子量的分析范围，离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电行数算出。电喷雾质谱的优势就是它可以方便地与多种分离技术联合使用，如液一质联用（LC－MS）是将液相色谱与质谱联合而达到检测大分子物质的目的。电喷雾电离质谱（ESI-MS）由于可以产生多电荷峰，与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围，同时提高了灵敏度，使一种M/Z限制在一定范围的四极质谱，就可以分析分子质量超过200ku的蛋白质。另外ESI-MS方法产生一系列的多电荷峰，可以得到准确的分子量，它还可与HPLC和高效毛细管电泳（CE）分离方法相连接,扩大了质谱在生物领域的应用。电喷雾发展过程电喷雾现象的出现可以追溯到两个世纪之前，但真正把电喷雾作为一种电离方法的创新性的研究是由Dole等在大约30前开始的，他们研究的目的是用电喷雾来产生气态大离子。1984年Yamashita等把大气压电喷雾电离技术与四极质谱结合起来，同年，Alexandror把它和磁质谱结合起来。1988年Fenn研究小组报道了用ESI-MS得到了带有45个正电荷分子量为40ku的蛋白质，随后ESI-MS在生物大分子的研究领域进入了一个全新的发展阶段。到目前为止，该法已经能够分析质量范围大约在200ku的蛋白质电喷雾电离过程1．电喷雾电离过程示意图附图电喷雾质谱的电离接口示意图如附图所示，在毛细管管口加一高电压，作用于经喷雾头进入离子化室的溶液，再将3~6kV的电压加到毛细管和相对的电极之间，电压导致毛细管末端的液滴表面的电荷增强，高电压导致液体表面分裂和多电荷液滴的形成，与毛细管子相对的电极携带的正或负电荷以产生正或负电荷液滴。对于电喷雾的整体而言，带电液滴的形成是整个电喷雾过程的第一步，而接下来的离子化是进行电喷雾分析的关键。而带电液滴形成分子离子的机制还不清楚。Iribane和Thomson提出场辅助离子蒸发假设。在这种模型中，处于液滴表面的离子是由于带电液滴的溶剂在空气中蒸发，当场力在液滴表面达到临界点时由液相直接进入气相完成离子化的过程。而Rollgen等提出了不同的假设机理，他认为当液滴在大气压下蒸发时，随着溶剂的蒸发，由于液滴直径变小，液滴表面电荷密度增加，当液滴表面电荷达到雷利极限（Raleighlimit），液滴进一步裂变，再次达到雷利极限，再一次“爆炸”，如此循环，当溶剂从小液滴中完全蒸发后形成分子离子。对于大分子化合物离子化过程的形成可用带电残渣模型理论加以解释，该理论认为大分子气相离子的形成是基于溶剂蒸发，由库仑爆裂辅助及较小液滴的相互排斥而导致液滴形成仅含有一个分子离子的气相离子，此过程所需能量很低，不会导致分子裂解。但是通过离子源内离子传输区的碰撞诱导解离（CID）电压设置可得到一些有效的碎片离子，但这只对一些不稳定结构有效，并且ESI-MS的CID质谱与电子轰击质谱（EI）及快原子轰击质谱（FAB）有一定的不同，可能是由于前者的开裂环境比EI及FAB源更为复杂，因此在对化合物结构的获得上有一定的制约。随着现代技术的发展，电喷雾与串联质谱（MS-MS）相连，即能为化合物提供很多结构信息。电喷雾电离质谱用于多肽与蛋白质分析质谱用于分析生物活性分子的研究，灵敏度高，并能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定。因此它已经成为解决生命科学中分析研究的重要手段。随着电喷雾电离技术的广泛应用，多肽与蛋白质分析近年来取得了相当大的成功。

蛋白质的分子质量的检测蛋白质的分子质量是一个重要的参数，而目前常用于测定蛋白质分子量的方法，如凝胶电泳或超速离心法，只有5%的精度，使蛋白质分子质量的估计不可靠。ESI-MS中所形成的多电荷离子可以直接用来准确地和高灵敏度地确定多肽与蛋白质的分子量。电子喷雾最近技术当今社会生命科学蓬勃发展，特别是随着基因组计划的快速、大规模推进，以及蛋白质组概念的出现，使生命科学的研究开辟了一个崭新的研究领域，而以ESI-MS