细胞培养讲课ppt

细胞培养技术主要内容1.细胞培养技术的相关概念2.细胞培养过程中的污染3.如何应对这些问题基本概念

细胞培养：指细胞在体外条件下，摸拟体内生长环境，使其在体外继续培养和增值。

原代培养：培养的动物细胞大都取自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。

传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代培养及传代培养的细胞在传至10代左右时就由于很多细胞不适应外界环境而不分裂，但有些细胞适应外界环境而仍然分裂生长，这样的细胞称细胞株，细胞系：当细胞培养至50代左右后，一般的细胞再也培养下去了，只有遗传物质发生改变的细胞而变成不死细胞继续活下去了。这样形成的细胞叫细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。基本概念细胞图样低倍显微镜高倍显微镜体外培养细胞的分型（一）贴附型细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependentcells)这种现象与细胞分化有关。按照培养细胞的主要形态可分为成纤维细胞型，上皮型细胞，游走细胞型，多形型细胞细胞贴壁过程（二）悬浮型

特点：不贴附在支持物生长，胞体圆形，在培养液中生长空间大，可长时间的生长，繁殖旺盛便于做细胞代谢研究。S180肉瘤、血液里的白细胞、K562、HL－60。分型的目的：方便描述细胞在培养过程中的形态变化。培养条件好时，细胞相对稳定，可反映出起源、正常异常的区别，作为判定细胞生物学性状指标。细胞培养中的污染一、细菌污染

细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。细胞培养中的污染二、真菌污染

真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。细胞培养中的污染三、支原体污染支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6-8.0)下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。常用的排除微生物污染的方法细菌污染小可用庆大霉素50~100ug/ml，万古霉素50ug/ml，氨卡青霉50~100ug/ml加入培养液中，次日换液。重度污染只有倒掉。支原体呈浅黑色“泥沙状”，可影响细胞的生长，使用卡那霉50~100ug/ml加入培养液中，次日换液，连续2周，能控制支原体。如果重度污染只有倒掉。真菌污染一般用氨卡青霉素50~100ug/ml，庆大霉素50~100ug/ml，制霉菌素1.5ug/ml加入培养液中对霉菌污染的细胞进行大剂量冲击处理，10小时后换液，能有效抑制霉菌的污染。应对方法

一、无菌的培养环境和齐全的设备----细胞培养房的条件是关键TextTextTextText超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。主要设备主要设备按构造分：正置显微镜

倒置显微镜二、规范的操作程序--所用器械要严按照规范的操作过程执行酒精灯离心管培养瓶镊子

三、常用试剂的制备酒精灯TEXTTEXT培养瓶1、常用培养基。我们实验中的均有公司提供

注：关注实际试验操作中的经验，关注PH值变化2、血清的选择与配置。小牛血清或胎牛血清培养细胞时从-20℃到4℃逐渐溶解，避免冷热变化3、EDTA的配置4、胰蛋白酶配置-20℃冰箱保存四、贴壁细胞的培养细胞培养过程中应注意的事项一：

细胞复苏过程中的一系列操作，要求动作迅速，复苏的时间的长短与细胞存活率成正比，并且要先在37度水浴锅中预热，复苏前细胞房严格消毒。四、贴壁细胞的培养细胞培养过程中应注意的事项二：

在细胞的传代培养中不能太多，细胞生长旺盛达到瓶底四分之三，但也不能太少。传代时把培养瓶内的液体轻轻倒掉，按胰蛋白酶与EDTA按1：1的混合物，（细胞消化的时间短，消化彻底且对细胞损伤小）对细胞进行消化。置室温内消化3~5分钟后按常规操作进行传代。四、贴壁细胞的培养细胞培养过程中应注意的事项三：

冷冻经过水液态—冰态加水态—冰态三个阶段，降温的速率十分重要，按照4℃冰箱40min，-20℃冰箱60min，-80℃冰箱内过存或液氮罐长期保存

注意：上述过程中要去掉上清液的时一定轻轻倒掉或用移液管吸掉培养液，过重、过快容易把细胞也去掉。五污染的防治（见前面）六细胞室要制定严格的规章制度，每天进行消毒，保持