组合靶基因传感器芯片及自动检测仪

组合靶基因传感器芯片

及自动检测仪负责人：府伟灵负责单位：西南医院检验科将压电传感器技术与基因芯片技术相结合适合临床基因检测的组合靶基因传感器阵列及其自动检测仪一研究内容与目标21.应用疾病诊断基因突变检测环境监测32.仪器特点价格低廉、便于携带使用方便、可实时监测无需标记、可长期保存检验灵敏度高可同时检测多个标本或同一标本多个基因4微型压电传感器阵列芯片的研制压电谐振阵列自动检测系统基因传感器芯片及封装、进样系统基因检测仪及应用软件特异性探针的设计和合成各种疾病标本的收集、保存与处理确定相应的检测项目对比实验二已完成的研究工作5一.杂交反应动力学等研究离子强度对杂交效应的影响温度对杂交效应的影响探针浓度对杂交效应的影响靶序列浓度对杂交效应的影响碱基不匹配对杂交效应的影响不同结合位点对杂交效应的影响不同探针长度对杂交效应的影响靶序列长度对杂交效应的影响金、银膜作传感器电极时检测对比扫描隧道显微镜观察61.离子强度对杂交效应的影响频率变化值随离子强度增加而增加石英晶体的振荡性能受溶液电解质浓度的影响缓冲液NaCl浓度以0.2M较为适宜72.温度对杂交效应的影响随温度增加，杂交时间有缩短趋势，杂交前后的频率差值逐渐减小随温度增加，靶序列与探针之间的离解率常数明显升高。83.探针浓度对杂交效应的影响杂交效率与探针的初始浓度有关。探针浓度增加，杂交所致频率变化值增大，但浓度过高时(1.0、3.5uM)，频率变化值反而有所下降。其原因可能主要与探针的空间排列结构和DNA分子间的静电排斥有关。94.靶序列浓度对杂交效应的影响靶序列浓度增加（从0.005uM到3.5uM），杂交所致频率差值逐渐增大，Δf与[target]0呈一饱和曲线关系。靶序列浓度为0.001uM、0.0001uM时，传感器未能检测出频率变化，此为灵敏度受限所致。提高灵敏度有多种方法，但在实际应用中的可行性还需进一步探讨。105.碱基不匹配对杂交效应的影响不匹配碱基数增加，靶序列与探针之间的结合率明显降低，而其离解率明显增高，表明碱基不匹配使DNA双链之间结合力减弱，更易离解。实验提示，应用压电传感器阵列技术可以判断两条互补链之间碱基不匹配情况，显示其具有很好的特异性。116.不同结合位点对杂交效应的影响靶序列分别在其3’端、5’端、及中间段与20碱基的探针互补杂交时，频率差值无明显差异，而中间段杂交时间有所延长。127.不同探针长度对杂交效应的影响在压电传感器上应用较长的DNA分子进行杂交检测时，频率效应更大，能更清楚地反映杂交情况，使实验误差更小。138.靶序列长度对杂交效应的影响短链靶序列(20~108个碱基)碱基数与△ｆ呈线性关系，而长链靶序列(225、379、654bp)时△ｆ增大趋势明显减缓。149.金、银膜作传感器电极检测对比检测基因时的稳定性、反应时间、频率变化幅度以及杂交动力学测定等方面均无显著差异。1510.扫描隧道显微镜观察针尖为电化学腐蚀的钨丝，以恒电流方式进行图像采集，在大气压和室温条件下，在纳米级水平直接观察金属膜表面形态学变化。16银膜空白电极照片。扫描范围2nm×2nm石英晶片上银原子分布均匀，排列有序

1.0uM、20碱基的探针固定在银膜上，6-巯基己醇封闭。扫描范围40nm×40nmDNA探针分子分布均匀，密度较大。由于显微镜在膜垂直方向上扫描幅度仅4nm，视野内看不到巯基己醇分子。1.0uM、20碱基的探针与1.0uM、20碱基的靶序列杂交，银膜。扫描范围40nm×40nmDNA双链分子分布均匀。与杂交前比较，视野内分子密度增加，分子增粗。17二.压电谐振阵列自动检测系统

频率采集电路计算机传感器阵列振荡电路参比传感器电磁屏蔽系统检测系统连接示意图181.电路系统通道选择电路压电谐振电路差频电路自动增益电路温度补偿电路计数电路自动寻址电路计算机接口电路19

压电传感器振荡电路图202.

2×5型传感器阵列AT切型基频10MHz晶膜直径4.0mm灵敏度0.1ng2×５型石英谐振传感器阵列示意图

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21传感器阵列及检测系统

223.软件系统数据多道采集模块数据分析模块数据统计模块结果报告模块234.检测仪包括系统组合、外型设计及配套部件等工作目前已初步成形。24四.检测MRSA的应用研究准确而快速地检测耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)，是有效控制其流行的关键，目前主张从耐药基因型进行检测诊断。应用压电传感器阵列，同时检测作为MRS耐药标志的mecA基因和金黄色葡萄球菌特有的femA基因，并与其它常用方法进行了对比，探讨应用压电传感器阵列技术检测MRSA的可行性。25统计分析显示：频率变化与靶DNA浓度显著相关，呈指数函数关系，并有关系式：

mecA[C]＝0.0003×e0.0414△FfemA[C]＝0.0003×e0.0336△F26从本实验可知，与其它检测方法相比，应用压电传感器阵列检测临床基因样品将有许多优势：①可以进行液相杂交定量检测②可以进行DNA实时检测③可以对多种DNA样品同时检测④特异性强⑤无污染27五.相关专利国内专利组合靶基因自动检测方法及采用该方法的检测仪.公开号:CN1261667A组合靶基因自动检测仪.申请号：99123576.2微型石英谐振阵列基因传感器芯片.申请号：99123577.0国际专利组合靶基因自动检测方法及采用该方法的检测仪.申请号：PCT/CN99/001921628六.论文发表及学术交流

美国微生物学会第100届年会PiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.2000年世界华人临床生化会议(香港)ApplicationofPiezoelectricGenosensorTechniquesforRapidDetectionofHumanPapillomavirus.美国圣地亚哥世界基因芯片大会Applicationofpieoelectricgenosenortechinquesforrapiddetectionofhumanpapillomavius29组合靶基因自动检测仪快速检测人乳头瘤病毒.中华检验医学杂志.2000;23(5):264-266应用压电基因传感器芯片检测结核分枝杆菌DNA.中华医院感染杂志.2000,10(6):418-420压电基因传感器芯片技术在快速快速检测人乳头瘤病毒中的应用.中国检验医学与临床，2000，1(1):23-24Multichannelpiezoimmunoassyfordetectionofbacteriaandvireuses.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):487PiPiezoeletricGenosensorBasedonPCRAmplicationandApplicationtoDetectionofHumanPapillomavirusOncogene.ChemicalJournalofChineseUniversityies.1999;20(Spl):42030压电基因传感器的研究进展.国外医学·临床生物化学与检验学分册。2001,(4)压电基因传感器的构建.第三军医大学学报.已接收探针浓度对