植物细胞培养

第5章植物细胞培养与次级代谢产物制备植物细胞培养是指在离体条件下，将愈伤组织或其它易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养增殖，获得大量细胞的一种技术。5.1植物细胞培养及特点2/4/20231细胞培养与组织培养的区别1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议：组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。2/4/20232植物细胞培养的特点与微生物相比细胞大（30-100倍）成团不耐剪切生长慢，周期长易污染（培养基适于微生物生长）光照影响较大，氧气、二氧化碳含量影响较大。2/4/202335.2植物细胞培养技术5.2.1培养基5.2.2植物单细胞分离与小规模培养2/4/202345.2.2.1单细胞分离方法（一）机械法具体做法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。2/4/20235（二）酶解法酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。(纤维素酶，果胶酶)优点可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。5.2.2.1单细胞分离方法2/4/20236细胞悬浮过滤与培养基混合植板培养克隆愈伤组织（三）愈伤组织诱导法振荡、或加酶解。5.2.2.1单细胞分离方法2/4/202375.2.2.1植物单细胞小规模培养培养方法（一）看护培养（二）饲养层培养（三）液体浅层静止培养（四）细胞同步化培养（五）细胞平板培养（六）微室培养2/4/20238（一）看护培养（nurseculture）Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程2/4/20239（二）饲养层培养Horsch等（1980）建立培养皿培养基饲养细胞层培养细胞看护滤纸转移滤纸2/4/202310（三）液体浅层静止培养细胞培养皿三角瓶静止2/4/202311（四）细胞的同步化培养细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。什么措施？2/4/202312细胞周期2/4/202313（1）体积选择法依据：细胞体积大小方法常规分选方法是梯度离心精细的分选可采用流式细胞仪优点操作简单分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用缺点分选精细度较差2/4/202314（2）低温处理可以提高培养体系中细胞同步化的程度Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。可能的原因不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。2/4/202315（3）饥饿法饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。2/4/202316（4）抑制剂法通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。2/4/202317（五）细胞平板培养(platingculture)指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。2/4/202318细胞平板培养（platingculture)平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。每个平板形成的细胞团数植板率＝每个平板接种的细胞总数2/4/202319细胞平板培养(platingculture)优点：单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。2/4/202320（六）微室培养

(microchamberculture)在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法。由Jones等在1960年设计的。优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。细胞起始密度：30～80个/室。2/4/2023212/4/2023225.2.3细胞系与细胞株细胞系（cellline）：是以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体。细胞株（cellstrain）：指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或提高筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。2/4/2023235.2.3.1细胞株筛选（一）一般步骤（1）愈伤组织的诱导。适宜外植体、培养基、激素（2）单细胞分离。固体培养基生长较快（3）细胞无性系的分离。液体培养基生长较快（4）细胞株筛选。选择目标产物含量高的（5）性能评价。可以中试（6）细胞株获得。2/4/202324（二）定向富集驯化（1）激素自养型细胞株的筛选驯化（2）耐高剂量有毒物质的细胞株驯化（乙酸盐苯甲酸盐）梅兴国（2001）通过在培养基中添加1.6mM的L-Phe，筛选出了抗Phe的红豆杉细胞悬浮系，其紫杉醇含量高于原型细胞3～5倍。（3）直选法

李志勇等（2002）直接从起始细胞中挑选不同细胞团建立了10个大蒜细胞悬浮系，比较研究显示，不同悬浮细胞系的SOD合成能力最大差异可达5倍。2/4/202325（三）人工诱变筛选细胞系统：（1）悬浮培养系统（2）愈伤组织系统（3）原生质体系统诱变方法（1）物理方法射线（2）化学方法亚硝基胍2/4/2023265.2.3.2细胞株保存（一）继代培养保存法时间？（二）低温保存法5-10℃10天（三）冷冻保存 （1）低温保存-20℃

（2）超低温保存液氮2/4/2023275.2.4植物细胞大规模悬浮培养◆根据培养规模：小规模和大规模（批量）培养◆根据培养方式：悬浮、平板、看护培养、固定化 悬浮培养分为：分批培养流加式培养半连续培养连续培养（恒化培养）◆根据要求产物：用于诱变和生产次生(级)产物(Secondaryproducts)的细胞培养2/4/2023285.2.4植物细胞大规模悬浮培养悬浮培养定义与优点细胞悬浮培养的应用用于建立悬浮培养的细胞应具备的特点悬浮系的建立过程成功的悬浮细胞培养体系特征悬浮细胞的生长动态衡量悬浮细胞生长状况的方法影响悬浮细胞生长的因素2/4/202329一、悬浮培养的定义与优点（1）定义：悬浮培养(Suspensionculture)是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。（2）优点

①

培养细胞可不断增殖，且生长速度快。

②

液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致。③可以借鉴发酵工程的成熟技术，容易放大实现产业化。2/4/202330二、细胞悬浮培养的应用Suspensioncells悬浮细胞Plants植株Artificialseeds人工种子Protoplasts原生质体Mutation突变体Secondaryproducts次级代谢产物2/4/202331①松散性好，疏松易碎。②其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。③呈细小颗粒状。④增殖快、再生能力强。适宜悬浮培养适宜再生植株三、用于建立悬浮培养的细胞应具备的特点：2/4/202332四、悬浮系的建立过程愈伤callus150~250ml摇瓶flask离心分离centrifugeisolation继代培养subculture1g/10mlmedium100~120rmpculturetransfer1time/3d80rpm2/4/2023332/4/202334五、成功的悬浮细胞培养体系具备的特征①悬浮培养分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下。②均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。③细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般7～10天便可增加一倍。④培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。2/4/2023352/4/202336六、悬浮细胞的生长动态2/4/202337七、衡量悬浮细胞生长状况的方法根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞质量变化。鲜重：真空减压过滤后称重，反应细胞生长情况干重：鲜细胞烘干至衡重，反应细胞质量生长速率(p)：不同时间细胞密度(x)的自然对数与起始密度(x0)的自然对数之差与培养时间(t)的比值

p＝(lnx-lnx0)/t2/4/202338八、影响悬浮细胞生长的因素起始愈伤组织的质量接种细胞密度：悬浮细胞的起始密度一般在0.5~2.5×105个细胞/毫升。接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长。最低有效密度：即能使细胞分裂、增殖的最低接种量。培养条件：培养基、方式、温度、继代周期。2/4/202339八、影响悬浮细胞生长的因素4.培养基应用条件培养基（生长过愈伤组织或悬浮细胞的液体培养基）提供单细胞生长和分裂所需的特殊代谢物。基本培养基成分的调节视不同的培养目的而定培养基设计时，一般均以诱导愈伤组织形成的培养基为基础进行调整。常用的培养基有MS、B5、LS、N6等。植物激素和其他附加成分的应用。2/4/202340八、影响悬浮细胞生长的因素5.培养方式：摇瓶，反应器（气动式、搅拌式）；分批培养，半连续培养和连续培养6.温度25℃7.继代周期指具有一定起始密度的细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止的一个过程。培养周期的长短是由起始细胞密度、延迟期的长短、生长速率等决定。继代培养（Subculture）：继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。2/4/202341植物细胞悬浮培养的生物反应器一、定义：生物反应器是指用于高等生物细胞批量化培养的装置及其相应控制系统。二、用于悬浮培养的反应器种类：

1.机械式

2.气动式包括气升式和鼓泡式三、气动式反应器的优缺点

1.优点剪切力小，对细胞伤害小，结构简单，功耗低，

2.缺点难适于细胞高密度培养2/4/202342四、适合植物细胞培养的反应器应该具备的特征有适宜的氧传递特点。能保证良好的液体流动性。较低的剪切力。方便调节光照。2/4/202343五、机械搅拌式反应器

（stirredtankbioreactor)（1）组成（2）优点搅拌均匀供氧和混合效果好（3）缺点

剪切力大2/4/2023442/4/202345六、气升式反应器

(air-liftbioreactor)Flash（1）组成：2/4/202346七、鼓泡式反应器

（Bubblingreactor）2/4/202347反应器类型体积（L）培养植物种类搅拌式7，15D.carota

胡萝卜搅拌式20，15500N.tabacum

烟草搅拌式5000C.roseus

长春花螺旋搅拌式20C.blumei

五彩苏提升搅拌式2.5P.elliotii

湿地松鼓泡式20，30，130P.ginseng人参鼓泡式65，1500N.tabacum

烟草外环气升式10，30，85C.roseus

长春花导筒气升式20，210D.lanata

狭叶毛地黄转鼓式1－4V.rosea

长春花植物细胞培养生物反应器2/4/2023485.2.5植物细胞固定化培养定义：细胞固定化（cellimmobilization）是指将游离的细胞包埋在支持物内部或表面，培养液呈流动状态进行培养的一种培养方式。优势：（1）细胞生长较为缓慢，利于次级代谢产物的积累。（2）利于保持培养液流体性质（3）剪切力小（4）利于进行连续培养和生物转化2/4/2023495.2.5植物细胞固定化培养固定形式：包埋式固定化培养系统：支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐和聚丙烯酰胺等附着式固定化培养系统：支持物多采用尼龙网、聚氨酯泡沫和中空纤维等。Alfermann等(1983)用气升式系统，采用海藻钙固定细胞成功地用30L和200L的反应器生产地高辛。Jose等(1983)进一步用中空纤维反应器培养胡萝卜和碧东茄生产代谢产物酚类物质Flash2/4/2023505.2.6植物细胞两相培养（一）两相培养(two—phaseculture)概念指在植物细胞培养基中加入有机溶剂或者有吸附作用的多聚化合物，形成的培养体系。培养体系由于分配系数不同而形成上、下两相，细胞在水相中生长并合成次生代谢物，这些次生代谢物又通过主动或被动运输的方式释放到胞外，并被另一相所吸附。能够减少产物反馈抑制作用，提高产物产量。2/4/2023515.2.6植物细胞两相培养（二）建立植物细胞两相培养体系应注意的事项：添加物对细胞无毒，不影响细胞生长与目的产物的合成。产物易溶于有机相或被多聚化合物吸附。两相容易分离添加相不吸收培养基的有效成分。2/4/2023525.2.6植物细胞两相培养（三）两相类型：液-液系统和液-固系统液-液系统：分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物。分离相和培养基的化学性质和比重不同。液-固系统：是指提取相以固态形式存在于系统中，主要通过吸附分离目的产物，目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂。2/4/202353

5.2.6植物细胞两相培养（四）红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇实验材料：东北红豆杉细胞系培养基：第一相：B5培养基，第二相：5％(v/v)的松油醇，产物释放剂：5％(v/v)二甲基亚砜。接种量:10g(鲜重)/100ml培养基/250mL三角烧瓶。培养条件：25℃，120rpm，黑暗培养。2/4/202354■细胞干重；▲紫杉醇产量；两相系统——；单相系统－－ 第二相的加入，使得紫杉醇产量提高到30.19mg/L，比对照增加103%；63％的紫杉醇从胞内的释放出来，其中有75％转移至有机相。2/4/2023555.3植物细胞培养生产次级代谢产物应用培养细胞系统合成有用的天然产物在医药、食品、轻化工业等领域具有重要意义。目前有约25％的法定药品来自植物，其有效成分均为次级代谢产物。许多植物次级代谢产物是优良的食品添加剂和名贵化妆品原料。有些是生物毒素的主要来源，可用于杀虫、杀菌，而对环境和人畜无害，是理想的环保产品2/4/202356部分代表性植物次级代谢产物及其植物资源工业用途次生产物植物资源药用代谢产物可待因罂粟薯蓣皂苷配基三角叶薯蓣奎宁金鸡纳树地高辛狭叶毛地黄莨菪胺曼陀罗长春花碱长春花杀虫剂除虫菊酯除虫菊食品，饮料留兰香薄荷化妆品茉莉油茉莉花2/4/2023575.3.1植物次级代谢产物的主要类型1.酚类化合物－黄酮类、醌类和简单酚类黄酮类： 结构：C6-C3-C6

生物合成前体：苯丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。 功效：为治理心血管疾病和高血压的药物成分。醌类化合物： 结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物， 种类：苯醌、萘醌。 功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。2/4/2023582.萜类化合物组成单元：异戊二烯合成途径：异戊二烯途径种类：单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。萜类化合物已超过2万种。单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值。倍半萜：抗疟疾药物青蒿素。二萜生物碱：抗癌药物紫杉醇。三萜皂甙：人参皂甙。甾体皂甙：薯蓣皂甙。2/4/2023593.含氮化合物包括：生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷种类：5500种以上分布：双子叶植物生物碱的作用：药用，植物抗毒素。目前对生物合成途径研究比较清楚的有：烟草的烟碱(nicotine)、毒藜碱(anabasine)和吡咯生物碱

(pyrrolizidinealkaloid)，毛茛科植物的小檗碱(berberine)，曼陀罗属植物的莨菪碱(tropine)和东莨菪碱(scopolamine)。烟碱2/4/2023605.3.2植物次级代谢产物的生物合成途径（一）聚酮途径又称乙酸丙二酸途径，乙酰辅酶A通过直线式聚合生成脂肪酸和环状次级代谢产物。植物聚酮类化合物主要包括酚类、芪类及类黄酮化合物等（二）莽草酸途径PEP与4-磷酸赤藓糖缩合，经过莽草酸生成芳香族氨基酸，进一步生成生物碱、类黄酮、香豆素等。（三）甲瓦龙酸途径又称甲戊二羟酸（甲羟戊酸）途径，是乙酰辅酶A经过甲戊二羟酸生成异戊二烯，再合成萜类、甾体、蒽醌等。2/4/2023615.3.3培养条件下植物细胞次生产物积累的特性生长偶联型产物合成与细胞生长成正比如长春花中长春花碱的合成、烟草细胞烟碱合成、薯蓣中薯蓣皂甙的合成。中间型产物仅在细胞生长下降时合成，细胞处于指数生长期或停止生长产物都不合成蒽醌类物质合成的植物细胞、莨菪烷类合成的植物细胞等属于此类型。非生长偶联型产物合成在细胞生长停止以后。如紫草宁。2/4/2023625.3.4提高细胞次生产物产量的途径1.选择适宜的起始材料－－种类、部位（基因型）栀子（Gardeniajasminoides）胚轴银杏 子叶当归 根红豆杉幼嫩的茎茜草叶柄2.培养基既要满足植物细胞的生物量增长，还要满足细胞合成及积累次生产物的需要。2/4/2023635.3.4提高细胞次生产物产量的途径3.前体（precursor）的应用作用：提高目的产物产量。紫草-L-Phe-紫草素选择对某一目的产物来讲可能有多种前体物质同一种前体物质又可能有多条代谢路径从而形成不同的代谢产物。针对其合成的关键生化过程进行前体物质添加。注意前体物质的使用时间。紫苏-色胺-week2注意前体浓度。过量也可能产生反馈抑制。2/4/202364人参皂甙的生物合成途径乙酰辅酶A

甲羟戊酸（MVA）反式角鲨烯（C30）

2,3-氧化鲨烯环阿屯醇达玛烯二醇香树素植物甾醇人参皂甙Rg1人参皂甙Ro2/4/2023655.3.4提高细胞次生产物产量的途径4.激发子（elicitor）的应用也称诱导子，是指能够诱导植物细胞中某些反应，并形成细胞特征性自身反应的分子。非生物激发子，如辐射、金属离子、茉莉酸类似物（茉莉酸甲酯，M-JA）等。生物激发子外源激发子：菌丝、微生物机体提取物及微生物产生的多糖、蛋白和脂肪酸等内源性激发子：来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。2/4/2023665.3.4提高细胞次生产物产量的途径激发子促进次生产物积累与其种类和浓度有关