大化实验三吸光光度法

第二章吸光光度法

2.1光谱分析法概述2.2吸光光度法基本原理2.3目视比色法与可见分光光度法2.4显色反应及显色条件的选择2.5吸光度测量条件的选择2.6分光光度法的应用1学习要求1.了解物质对光的选择性吸收；2.掌握光的吸收定律；3.掌握比色分析和吸光光度分析方法及其仪器；4.了解显色剂及显色反应条件的选择，光度测定条件的选择；5.了解吸光光度法的应用。2

2.1光谱分析法概述

一、光分析法及其特点

光分析法：基于电磁辐射能量与待测物质相互作用后所产生的辐射信号与物质组成及结构关系所建立起来的分析方法；电磁辐射范围：r射线～无线电波所有范围；相互作用方式：发射、吸收、反射、折射、散射、干涉、衍射等；光分析法在研究物质组成、结构表征、表面分析等方面具有其他方法不可区代的地位；3三个基本过程：（1）能源提供能量；（2）能量与被测物之间的相互作用；（3）产生信号。基本特点：（1）所有光分析法均包含三个基本过程；（2）选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色谱分析）；（3）涉及大量光学元器件。4二、电磁辐射的基本性质

电磁辐射（电磁波）：以接近光速（真空中为光速）传播能量；电磁辐射具有波动性和微粒性；

c：光速（3×1010cm/s）

；λ：波长；ν：频率；σ：波数；E：能量；h：普朗克常数光的波长越短（频率越高），其能量越大。

c

描述波动性的基本关系式：λ=—(nm)

ν

粒子性，光电效应：光吸收与发射→光量子→粒子性

c

光子能量：E=hν=h—λ

（普朗克方程）↘，E↗；↗，E↘5辐射能的特性：

(1)吸收物质选择性吸收特定频率的辐射能，并从低能级跃迁到高能级；

(2)

发射将吸收的能量以光的形式释放出；

(3)散射丁铎尔散射和分子散射；

(4)折射折射是光在两种介质中的传播速度不同；

(5)反射

(6)干涉干涉现象；

(7)衍射光绕过物体而弯曲地向他后面传播的现象；

(8)偏振只在一个固定方向有振动的光称为平面偏振光。678三、光分析法分类

一）.光谱法：

基于物质与辐射能作用时，分子发生能级跃迁而产生的发射、吸收或散射的波长或强度进行分析的方法；光谱法：原子光谱、分子光谱；

91、原子光谱（线性光谱）：基于原子外层电子跃迁的原子吸收光谱（AAS）；原子发射光谱（AES）、原子荧光光谱（AFS）；基于原子内层电子跃迁的X射线荧光光谱（XFS）；基于原子核与射线作用的穆斯堡谱；10

2、分子光谱（带状光谱）：

基于分子中电子能级、振-转能级跃迁；可见光谱法；紫外光谱法（UV）；

红外光谱法（IR）；

分子荧光光谱法（MFS）；

分子磷光光谱法（MPS）；

核磁共振与顺磁共振波谱（N）；

11原子光谱为线状光谱，分子光谱为带状光谱；为什么分子光谱为带状光谱？原子光谱图分子光谱图12二）、非光谱法：

不涉及能级跃迁，物质与辐射作用时，仅改变传播方向等物理性质；偏振法、干涉法、旋光法等；13光分析法光谱分析法非光谱分析法折射法圆二色性法X射线衍射法干涉法旋光法原子吸收光谱原子发射光谱原子荧光光谱X射线荧光光谱原子光谱分析法分子光谱分析法紫外光谱法红外光谱法分子荧光光谱法分子磷光光谱法核磁共振波谱法14四、光分析方法的进展

1.采用新光源，提高灵敏度级联光源：电感耦合等离子体-辉光放电；激光蒸发-微波等离子体

2.

联用技术电感耦合高频等离子体（ICP）—质谱激光质谱：灵敏度达10-20g3.新材料光导纤维传导，损耗少；抗干扰能力强；15

4.交叉电致发光分析；光导纤维电化学传感器

5.检测器的发展电荷耦合阵列检测器光谱范围宽、量子效率高、线性范围宽、多道同时数据采集、三维谱图，将取代光电倍增管；光二极激光器代替空心阴极灯，使原子吸收可进行多元素同时测定；16

在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,按所用光的波长不同分为:

红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。

紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。

可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。本章主要讲授紫外可见吸光光度法。五、吸光光度法17六、可见吸光光度法特点

比色分析和可见光光度法主要应用于测试样中微量组分，与滴定分析、重量分析法相比，有如下特点：1、灵敏度高下限一般可达：10-5~10-6mol/L2、准确度高相对误差：比色法5~6%，光度法2~5%3、操作简便、测定快速4、应用广泛

182.2吸光光度法基本原理一、物质对光的选择性吸收

1．光区（10～1000m）白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成)光的互补:若两种不同颜色的单色光按一定的强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为互补色光，这种现象称为光的互补。互补光：按一定比例混合为白光的两种光19波长/nm400~430430~480480~500500~560560~590590~620620~760颜色紫色蓝色青色绿色黄色橙色红色可见光区：400-760nm紫外光区：近紫外区200-400nm

远紫外区10-200nm（真空紫外）202、物质的颜色完全吸收完全透过吸收黄色光光谱示意表观现象示意复合光Why???

光作用于物质时，物质吸收了可见光，而显示出特征的颜色。物质呈现的颜色与光有着密切的关系，物质呈现何种颜色，与光的组成和物质本身的结构有关。21

物质的电子结构不同，所能吸收光的波长也不同，这就构成了物质对光的选择吸收基础。

物质选择性地吸收白光中某种颜色的光，物质就会呈现其互补色光的颜色。

溶液颜色的深浅，取决于溶液中吸光物质浓度的高低。

223、光吸收曲线

分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；不同波长的单色光照射，吸光度不同—吸收曲线与最大吸收波长

max23吸收曲线的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同24吸收曲线的讨论：(3)吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。(4)不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。(5)在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。25二、光的吸收基本定律1.吸光度与透光率透光度(透光率)T

:描述入射光透过溶液的程度:

T=I

t/I0

（T：0~100%）吸光度A＝lg（I0/It)（A：0～∞）吸光度A与透光度T的关系:

A

＝－lg

T全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%26

2.朗伯(Lambert)定律

布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b

3.比耳(Beer)定律

1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c

27

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；

b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

c：溶液的物质的量浓度，单位mol·L－１；

ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的浓度，单位g·L－１

a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１

a与ε的关系为：

a=ε/M

（M为摩尔质量）4.朗伯—比耳定律

二者的结合称为朗伯—比耳定律，数学表达式285.朗伯—比耳定律的物理意义一束平行单色光通过有色溶液，溶液的吸光度与溶液的浓度和厚度成正比，其数学表达式为：

A＝

lg（I0/It)=εbc

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；29

6.吸光系数

摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。30（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）可作为定性鉴定的参数；（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。

摩尔吸光系数ε的讨论31（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。

ε>105：超高灵敏；

ε=(6～10）×104

：高灵敏；

ε<2×104：不灵敏。（6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。32

7.吸光度A的加和性

则总浓度等于各个组分吸光度之和：

A=A1+A2+..........+An

溶液中有几种吸光物质，彼此间不发生化学反应，则可：33三、标准曲线A

＝－lg

T=εbc

标准曲线：A-C（吸光度-浓度）曲线，又称校准曲线或工作曲线

01234C/mol·L-1A。。。。*0.80.60.40.20故由曲线的斜率即可求出ε34四.偏离朗伯—比耳定律的原因

标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯—比耳定律的偏离。引起这种偏离的因素（两大类）：

（1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；

（2）化学性因素。35（1）物理性因素难以获得真正平行的纯单色光。朗—比耳定律的前提条件之一是入射光为平行的单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯—比耳定律的正或负偏离。

非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯—比耳定律的偏离，最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。

36A克服方法：尽量选用较好的单色器入射波长选择在峰值位置（在波峰有一个A值相差较小的区域）2.非平行入射光导致光束的平均光程b′大于吸收池厚度b，实际测得的吸光度大于理论值，产生正偏离。37

朗—比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合，当溶液浓度c>10-2mol/L时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。

故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。

(2)化学性因素A散射、假吸收。克服方法：避免溶液产生胶体或浑浊入射光会因散射而损失，导致T减小，实测的A偏高38溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。例：铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：

2CrO42-＋2H＋=Cr2O72-＋H2O

溶液中CrO42-、Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液pH对测定有重要影响。392.3目视比色法与可见分光光度法

一.目视比色法

1.用同质材料的比色管

2.配制不同量的标准溶液

3.同量的显色剂，相同的实验条件，配成一套标准色阶

4.待测物与标准色阶的配制条件相同，置于色阶中比较颜色度40c4c3c2c1c1c2c3c4特点：简单、可测微量，复合光，误差大。观察方向观察方向41

可见分光光度计二、可见光分光光度法

42一、基本组成光源单色器样品室检测器显示1.光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。43

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；

④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。443.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。5.结果显示记录系统

检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理45二、分光光度计的类型1.单光束

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。2.双光束

自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。463.双波长

将不同波长的两束单色光(λ1、λ2)快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。472.4显色反应及显色条件的选择一、显色反应的选择1.选择显色反应时，应考虑的因素

灵敏度高、选择性高、生成物稳定、显色剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之差：“对比度”，要求△>60nm。2.配位显色反应

当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。483.氧化还原显色反应

某些元素的氧化态，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后测定。

例如：钢中微量锰的测定，Mn2＋不能直接进行光度测定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋

+10SO42-＋16H+

将Mn2＋

氧化成紫红色的MnO4＋后，在525nm处进行测定。494.显色剂无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。有机显色剂：种类繁多

偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。

三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等50二、显色反应条件的选择1.显色剂用量

吸光度A与显色剂用量CR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。2.反应体系的酸度

在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的pH范围。3.显色时间与温度

实验确定4.溶剂

一般尽量采用水相测定，51三、共存离子干扰的消除1.加入掩蔽剂

选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。例：测定Ti4＋，可加入H3PO4掩蔽剂使Fe3+(黄色)成为Fe(PO４)23-(无色)，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁S光度法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为Fe2+，消除Fe3+的干扰。2.选择适当的显色反应条件3.分离干扰离子52四、提高光度测定灵敏度和选择性的途径1.合成新的高灵敏度有机显色剂2.采用分离富集和测定相结合3.采用三元(多元)配合物显色体系

由一个中心金属离子与两种(或两种以上)不同配位体形成的配合物，称为三元(多元)配合物。多元配合物显色反应具有很高的灵敏度，一方面是因为多元配合物比其相应的二元配合物分子截面积更大；另一方面是因为第二或第三配位体的引入，可能产生配位体之间、配位体与中心金属离子间的协同作用，使共轭π电子的流动性和电子跃迁几率增大。三元配合物主要类型有：三元离子缔合物、三元混配配合物、三元胶束(增溶)配合物。532.5吸光度测量条件的选择

一.入射光波长的选择

一般应该选择λmax为入射光波长。如果λmax处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。54I0It参比I0´IrI0´

=Ir

+Ia+ItIaI0´IrI0´

–Ir

=Ia+ItI0´

=Ir

+I0

真正进入溶液部分的入射光

二.参比溶液的选择为什么需要使用参比溶液？

测得的的吸光度真正反映待测溶液吸光强度。55参比溶液的选择一般遵循以下原则：

⑴若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水)作参比溶液；⑵若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液本身无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；56

⑶若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸收，则可用“试样空白”(不加显色剂)作参比溶液；

⑷若显色剂、试液中其它组分在测量波长处有吸收，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。57参比溶液的选择原则：扣除非待测组分的吸收A（样）=A（待测吸光物质）+A（干扰＋池）A（参比）=A（干扰+池）M无色+R=MR有色试液不只是M试剂不只是R示意图参比液无色无色

MR

溶剂空白有色无色M’MR试样空白无色有色MRR’试剂空白有色有色M’MRR’显色空白58三.吸光度读数范围的选择浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关。

不同的透光度读数，产生的误差大小不同：

－lgT=εbc微分：－dlgT＝－0.434dlnT=-0.434T-1

dT

=εbdc两式相除得：

dc/c=（0.434/TlgT

）dT

以有限值表示可得：

Δc/c=（0.434/TlgT）ΔT

59浓度测量值的相对误差（Δc/c）不仅与仪器的透光度误差ΔT有关，而且与其透光度读数T的值也有关。

是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？60最佳读数范围与最佳值

设：ΔT=1%，则可绘出溶液浓度相对误差Δc/c与其透光度T的关系曲线。如图所示：当：ΔT=1%，T在15%～65%之间时，浓度相对误差较小，最佳读