多沙唑嗪对映体在动物心血管系

多沙唑嗪对映体在动物心血管系统的手性药理学研究研究生姓名：孙家安导师：任雷鸣教授引言多沙唑嗪（doxazosin，DOX）最早由Pfizer制药公司研制成功并于1988年首先在丹麦上市喹唑啉环衍生物,选择性α1受体阻断剂同时扩张阻力血管和容量血管临床应用良性前列腺增生患者下尿路症状降低血压对血脂代谢有良好的改善作用明显降低血浆甘油三酯和总胆固醇水平，能降低低密度脂蛋白、提高高密度脂蛋白胆固醇水平，使HDL/LDL和（HDL-C）/TC比值显著升高，减少血管壁的胶原合成，明显降低冠状动脉疾病的易患性和危险性DOX的意外退出多沙唑嗪提前退出抗高血压和降脂治疗预防心肌梗死的大规模临床试验（ALLHAT）α受体阻断剂也因此退出了高血压治疗的一线用药（JNC7)DOX是否会导致心力衰竭及致心衰作用是否源于其α受体阻断作用一直饱受争议最近的大规模临床研究又发现多沙唑嗪作为追加用药用于治疗高血压病不会增加心力衰竭的发病率(ASCOT)目前DOX作为高血压治疗的辅助用药仍然在临床得到广泛的应用，尤其适用于同时合并有高血压及BPH患者的治疗多沙唑嗪对映体多沙唑嗪存在一对对映体[(-)DOX与(+)DOX]，而目前应用于临床的是其外消旋体[(±)DOX]。生物体内广泛存在具有手性识别能力的生物大分子，当手性药物与其相互作用时将产生立体选择性的不同效应，从而体现不同的药效学和药代动力学特征。因此，DOX对映体在生物体内的立体选择性研究有着重要的科学价值和现实应用意义。在不同组织的立体选择性前列腺组织的选择性，(-)DOX、(+)DOX及(±)DOX三者的pA2值相近(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX拮抗苯肾上腺素诱发兔膀胱逼尿肌收缩反应的pKB

值相近(-)DOX在兔离体胸主动脉、颈总动脉、耳动脉、肠系膜动脉和肺动脉五种血管标本上血管平滑肌α1受体的拮抗参数均明显小于(+)DOX我们研究了(±)DOX及其两种对映体对离体心房心肌收缩力和心率的影响，并与同样是喹唑啉类高选择性α受体阻断药的阿夫唑嗪（alfuzosin，ALF）及其对映体做了对比。心功能受损时导致激素与促炎细胞因子分泌脑利钠肽（BNP）、核因子-κB（NF-κB）及白细胞介素-6（IL-6）均是心力衰竭发生的血清生物学标志物。BNP是在心室张力增加时主要由心室分泌的一种激素物质，具有利尿利钠的作用。NF-κB是广泛存在于体内的一种转录因子，主要调控炎症介质及免疫反应基因的表达。多种病因心力衰竭患者的体内均可发现存在NF-κB的激活。IL-6是一种重要的炎症介质，其血清浓度也与心力衰竭心肌收缩力有相一定关系。DOX对心肌收缩力影响的机制DOX对映体的α受体阻断外作用蛋白激酶C通过激活Na+/K+ATP酶、肌钙蛋白和ATP敏感钾通道，降低心肌收缩力磷脂酶C的使二磷酸磷酯酰肌醇(PIP2)磷酸化产生三磷酸肌醇（IP3），刺激大鼠心肌收缩。NO可活化鸟苷酸环化酶，通过cGMP-PKG信号途径调控心肌细胞的L型钙通道，产生抑制心肌收缩力的作用。而cAMP也参与了药物诱导大鼠心肌正性肌力作用的机制。血浆蛋白结合研究的意义药物与血浆蛋白结合的变化显著影响其药代动力学和药效学。对映体蛋白结合率的不同往往是它们药代动力学差异的原因之一。对映体蛋白结合的立体选择性研究是明确其药理学效应、临床疗效及安全性必不可少的内容。我室研究发现多沙唑嗪对映体对心肌收缩力具有相反的作用，且服用消(±)DOX后两对映体的血药浓度不同有必要对多沙唑嗪对映体蛋白结合的立体选择性进行研究。研究内容多沙唑嗪对映体对心率、心肌收缩力及心衰生物学标志物的影响多沙唑嗪对映体在大鼠、犬和人血浆中的蛋白结合率研究多沙唑嗪对映体诱发大鼠心房肌收缩力变化的作用机制第一部分

多沙唑嗪对映体对心率、心肌收缩力及心衰生物学标志物的影响

研究内容本研究采用小鼠离体心房组织，观察(±)DOX及其两种对映体、(±)ALF及其两种对映体对小鼠离体心房心肌收缩力和心率的影响观察长期给予多沙唑嗪及其对映体对大鼠血浆氨基末端脑钠肽前体（amino-terminalpro-brainnatriureticpeptide，NT-proBNP）、IL-6及NF-κB水平的不同影响。

材料与方法

仪器FA2004型电子天平

SC-15数控超级恒温槽

BL-420E+生物机能实验系统

YSD-4G药理生理实验多用仪DNM-9602酶标仪白洋B600B台式低速离心机

药品

甲磺酸消旋多沙唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司甲磺酸左旋多沙唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司甲磺酸右旋多沙唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司甲磺酸消旋阿夫唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司甲磺酸左旋阿夫唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司甲磺酸右旋阿夫唑嗪

华北制药集团新药研究开发有限责任公司NT-proBNP检测试剂盒

上海源叶生物有限公司NF-κB检测试剂盒

上海源叶生物有限公司Interleukin-6检测试剂盒

上海源叶生物有限公司实验动物

KM小鼠，雄性，体重35~45g；SD大鼠，雄性，300~320g，均由河北省实验动物中心提供。饲养于室温23℃±1℃，相对湿度50±5%，明暗各12小时的清洁级动物实验室内，自由进食和饮水。

标本的制备

右心房（含窦房结）标本以25%乌拉坦（1.5g·kg-1）腹腔注射麻醉动物后，经颈动脉放血处死动物。小鼠处死后，迅速开胸，剪断与心脏相连大血管，取出心脏置于95%O2+5%CO2预饱和的冷Krebs溶液中，沿房室沟剪去心室，小心剪下右心房（勿损伤窦房结）。在右心房两端尖部各系一丝线，一端固定于麦氏浴槽底部，另一端连接张力换能器，并通过生物机能实验系统（BL-420E+）记录右心房自发性收缩反应。麦氏浴槽内盛有10ml的Krebs溶液，持续充以95%O2+5%CO2的混合气体，维持温度37±0.25℃。初始前负荷0.8g，10min后以0.1g单位逐步升高前负荷，直至标本的收缩反应达到最适状态。平衡1h，其间每20min换液一次。标本平衡1h后开始实验。

左心房标本

同法取出心脏标本，沿房室沟剪去心室，小心剪下左心房。在左心房两端尖部各系一丝线，一端固定于带有刺激电极的支架上，置于麦氏浴槽底部，另一端连接张力换能器。初始前负荷0.5g，标本平衡30min后，电刺激（波宽2ms，频率4Hz，120%阈电压）驱动左心房肌收缩，并通过生物机能实验系统（BL-420E+）记录心肌收缩时的张力变化。电刺激期间，以0.1g单位逐步升高前负荷，直至标本的收缩反应达到最适状态。麦氏浴槽内盛有10mlKrebs溶液，连续充以95%O2+5%CO2的混合气体，维持温度在37±0.25℃。电刺激1h后开始实验。

实验分组和处理

(±)DOX和(±)ALF及二者的对映体对小鼠离体右心房心率的影响

实验分七组，即(-)DOX、(+)DOX、(±)DOX、(-)ALF、(+)ALF、(±)ALF组和溶剂对照组。六个药物的浓度均配制成2mmol·L-1。按照3、10和30μmol·L-1的终浓度，采用累积给药法加入浴槽中，每个标本只给予一种药物。溶剂对照组同法给予等容积的蒸馏水。记录实验数据时，对于给药后出现停博的标本不再计数心率；其他标本均按实际标本数计数心率指标。以第一次给药前10s内的平均心率作为药前值；每次给药后，记录药后第20min时10s内的平均心率作为药物的效应。

实验分组和处理

(±)DOX和(±)ALF及二者的对映体对小鼠离体左心房心肌收缩力的影响电刺激1h后，开始实验。实验分组、药物配制、给药方法同小鼠离体右心房实验。记录实验数据时，以第一次给药时的前3s内平均收缩张力作为药前值；给药后，记录药后第20min时3s内的平均收缩张力作为药物的反应。

实验分组和处理

(±)DOX及其对映体12周连续灌胃给药对大鼠血浆NT-proBNP、NF-κB及IL-6的影响SD大鼠40只，按体重随机分为溶剂对照组、(-)DOX组、(+)DOX组、(±)DOX组，每组10只。溶剂对照组灌服等容量蒸馏水，给药组均给予相应的药物（8mg·kg-1），给药容积10ml·kg-1。每周固定时间称大鼠体重一次，根据新的体重调整给药剂量。每周给药7天，连续12周。末次给药前大鼠禁食12小时，给药后8小时，戊巴比妥钠（50mg·kg-1）皮下注射麻醉大鼠，沿腹白线切开大鼠腹部，小心剥离，暴露大鼠腹主动脉,采用一次性使用静脉采血针及生化管（含肝素抗凝剂）收集大鼠血液5mL，-20℃保存，离心3000转，10分钟，分离血浆，保存于-20℃冰箱。

指标检测

酶联免疫吸附实验法测定NT-proBNP、NF-κB及IL-6浓度。从室温放置20min后的铝箔袋中取出所需板条，设置标准品孔和样本孔。标准品孔各孔加入不同浓度的标准品50μL；样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；标准品和样本孔每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL。用封板腊封住反应孔，37℃恒温箱温育60min；弃去液体，吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1min；甩去洗涤液，吸水纸拍干，反复5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min；每孔再加入终止液50μL；15min内，在450nm波长处测定各孔的光密度（OD）值。在EXCEL工作表中，以标准品浓度作横坐标，以OD值作纵坐标，绘制标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度。

统计学处理

实验数据以实测值和变化率的mean±SD表示。同一药物不同浓度间的显著性检验采用单因素方差分析和Dunnett'stest；两组间实验数据的比较采用组间t检验。血浆指标的显著性检验采用单因素方差分析和Bonferroni'stest。统计学分析及图形处理使用GraphPadPrismversion5.00软件（SanDiegoCaliforniaUSA）。结

果

Cardiacarrestofisolatedmouserightatriuminducedbydoxazosin,alfuzosinandtheirenantiomersGroupsnCardiacarrestnumbers/Preparationnumbers3μmol·L-110μmol·L-130μmol·L-1Doxazosin(-)Doxazosin

120/12(0)0/12(0)1/12(8.3)

(+)Doxazosin160/16(0)0/16(0)5/16(31.3)(±)Doxazosin120/12(0)1/12(8.3)1/12(8.3)Alfuzosin(-)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(+)Alfuzosin100/10(0)0/10(0)0/10(0)(±)Alfuzosin120/12(0)0/12(0)0/12(0)Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Concentration(μmol·L-1)Heartrate(beats·min-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0346.67±38.46348.33±33.53366.25±34.03356.67±44.183333.33±33.39300.00±42.64230.00±82.30**293.33±35.51*(-3.51±7.16)(-13.63±12.73)＃＃(-38.90±22.13)△△(-16.98±11.34)△△＃＃10338.33±39.50218.33±82.00**143.75±77.71**174.55±57.33**(-2.26±7.12)(-35.19±25.35)△△＃＃(-61.30±20.96)△△(-50.26±18.18)△△30335.00±36.31172.73±80.63**61.82±47.71**89.09±45.92**(-3.15±6.44)(-45.09±34.69)△△＃＃(-83.47±12.23)△△(-74.97±15.66)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmouserightatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=11.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△△

P<0.01vscontrol,＃＃P<0.01vs(+)doxazosin.

Effectsofalfuzosinanditsenantiomersonheartrateintheisolatedmoucerightatrium

ConcentrationHeartrate(beats·min-1)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0346.67±38.46328.00±34.25360.00±48.07340.00±22.563333.33±33.39314.00±28.36342.00±50.29330.00±31.33(-3.51±7.16)(-3.68±10.08)(-4.91±6.82)(-2.96±6.14)10

338.33±39.50298.00±30.48326.00±38.93320.00±33.03(-2.26±7.12)(-8.73±8.71)

△(-9.03±7.30)△(-5.85±7.55)30335.00±36.31282.00±25.73**306.00±32.73*305.00±34.25*(-3.15±6.44)(-13.05±7.27)△△(-14.27±9.75)

△△(-10.32±7.75)△△Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10~12.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,

△△P<0.01vscontrol.ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)Doxazosin0120.00±32.66123.00±32.34135.00±27.59126.00±33.733116.00±34.71148.00±36.45126.00±28.36147.00±65.84(-3.80±6.87)(21.56±17.28)△△(-6.86±10.27)(14.33±27.98)△10118.00±46.62205.00±54.21**119.00±31.43160.00±55.38(-4.06±11.87)(67.59±25.32)△△#(-12.39±13.69)△(28.01±37.82)△△30114.00±35.34307.00±82.87**114.00±30.98220.00±72.72**(-5.71±5.07)(151.51±49.05)△△##(-15.89±12.98)△△(78.43±58.68)△△EffectsofdoxazosinanditsenantiomersoncontractileforceintheisolatedmouceleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug,△P<0.05,△△P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vs(±)doxazosin.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Alfuzosin(+)Alfuzosin(±)Alfuzosin0120.00±32.66122.00±46.62117.00±26.69129.00±33.813116.00±34.71121.00±48.18115.00±31.71121.00±33.48(-3.80±6.87)(-1.43±9.55)(-1.75±12.86)(-6.47±3.80)10118.00±46.62117.00±44.73114.00±28.36121.00±38.43(-4.06±11.87)(-3.69±10.21)(-1.07±19.12)(-6.70±10.42)30114.00±35.34120.00±49.22115.00±25.50125.00±33.42

(-5.71±5.07)(-2.08±10.87)(-0.67±14.55)(-2.96±7.38)EffectsofalfuzosinanditsenantiomersoncontractileforceinthemouceisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=10.Concentration(ng·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin(±)DoxazosinNT-proBNP475.55±150.21635.00±343.52*375.55±127.09424.12±134.19NF-κB

888.46±343.36705.77±193.34*1140.00±365.26910.38±276.39IL-648.81±23.3975.13±21.5859.44±23.1770.19±37.44EffectsofdoxazosinanditsenantiomersonplasmaNT-proBNP,NF-κBandIL-6levelsintheratDatawereexpressedasmean±SD,n=10.*P<0.05vs(+)doxazosin.小结

DOX对小鼠离体心房的心率和心肌收缩力具有明显的影响，高浓度尚可诱发心脏停博反应；DOX的手性结构对其上述活性具有明显的影响。ALF仅轻度抑制小鼠心率，ALF的手性结构对其心脏效应无明显影响。长期灌胃给予DOX及其对映体未显著影响大鼠心衰生物学标志物NT-proBNP及IL-6的血浆浓度；但是，(+)DOX组大鼠的血浆NF-κB水平显著高于(-)DOX组，提示(+)DOX对机体免疫及炎症反应有一定的影响。第二部分

多沙唑嗪对映体诱发大鼠心房肌收缩力变化的作用机制

ALLHAT实验中，DOX组具有较高的心血管事件，尤其是诱发充血性心力衰竭，因此使α受体阻断剂退出了高血压治疗的一线用药。然而在正常生理状态下，对于心肌收缩力而言α1受体的影响相对于β受体微不足道我们实验室首次证实了DOX分子结构中的手性碳原子，对其对映体阻断兔前列腺平滑肌功能性α1A受体的活性无影响；但是显著影响了其对映体阻断大鼠主动脉功能性α1D受体的活性。DOX两对映体在大鼠离体心房肌标本，产生了非α1受体介导的、完全相反的两种变力效应。

有研究发现(+)DOX可诱导心肌细胞凋亡，使心肌细胞数减少，并且这种作用与药物阻断α受体无关。Lee等发现，(+)DOX可抑制房室结组织的I(Ca，L)电流，致心律失常发生；而同为喹唑啉类的α受体阻断药bunazosin无此作用。在前述研究中，我们再次证实，(+)DOX对小鼠离体心房的心率和心肌收缩力具有明显的影响，高浓度尚可诱发心脏停博反应；DOX的手性结构对其上述活性具有明显的影响。相反，同为喹唑啉类的α1受体阻断剂阿夫唑嗪的手性结构对其心脏效应无明显影响。有关(+)DOX产生的非α1受体介导的心脏作用，国际上已有一些文献报道

建立了(-)DOX诱发的大鼠离体左心房正性肌力模型以及(+)DOX诱发的大鼠离体左心房负性肌力模型；酚苄明阻断α1受体和α2受体、阿托品阻断M胆碱受体、普萘洛尔阻断β受体、吲哚美辛阻断前列腺素合成、维拉帕米阻断L-型钙通道、亚甲蓝抑制可溶性鸟苷酸环化酶、H-89抑制cAMP依赖性蛋白激酶等条件下，DOX对映体诱发大鼠心房肌正性肌力作用或负性肌力作用的机制。本部分的研究内容材料与方法

FA2004型电子天平

上海良平仪器仪表有限公司SC-15数控超级恒温槽

宁波天恒仪器厂BL-420E+生物机能实验系统

成都泰盟科技有限公司YSD-4G药理生理实验多用仪

安徽蚌埠医学院无线电二厂PHS-3C数字酸度计

杭州东星仪器设备厂50μl微量进样器

上海医疗激光仪器厂石英亚沸高纯水蒸馏器（SYZ-B）

江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司YQY–12型氧气减压器

上海减压器厂有限公司仪器

药品配制精确称取左旋多沙唑嗪以及右旋多沙唑嗪，加适量双蒸水定容，超声20min。溶液储存于棕色瓶中，置阴暗干燥处保存备用。营养液的配制Krebs营养液的成份为（mmol·L-1）：NaCl118.3、KCl4.6、CaCl22.5、MgSO41.2、NaH2PO41.0、NaHCO325.0、glucose11.1。除NaHCO3、CaCl2和glucose于实验前临时加入外，其他成份均配成高浓度母液并于临用前稀释至所需浓度。配制好的营养液以95%O2+5%CO2的混合气体充分饱和后，用盐酸调pH值至7.4。实验动物Wistar大鼠，雄性，250~350g/只，由河北省实验动物中心提供。饲养于室温23℃±1℃，相对湿度50±5%，明暗各12小时的清洁级动物实验室内，自由进食和饮水。

以25%乌拉坦（1.5g•kg-1）腹腔注射麻醉动物后，经颈动脉放血处死动物。动物处死后，迅速打开胸腔，剪断与心脏相连大血管，取出心脏置于95%O2+5%CO2预饱和的4℃Krebs溶液中，沿房室沟剪去心室，小心剪下左心房。在左心房两端尖部各系一丝线，一端固定于带有刺激电极的支架上，置于麦氏浴槽底部；另一端连接张力换能器。麦氏浴槽内盛有10mlKrebs溶液，标本持续通以95%O2+5%CO2的混合气体，维持浴槽温度在37±0.25℃。初始前负荷0.5g，标本平衡30min后，电刺激（波宽2ms，频率4Hz，120%阈电压）驱动左心房肌收缩，通过生物机能实验系统（BL-420E+）记录心肌收缩时的张力变化。电刺激期间以0.1g单位逐步升高前负荷，直至标本的收缩反应达到最适状态，1小时后开始实验。实验方法

阿托品及普萘洛尔对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入10-6mol•L-1的阿托品和10-5mol•L-1的普萘洛尔，分别阻断M胆碱受体和β受体；阿托品及普萘洛尔与标本作用10min后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。以第一次给予DOX时的前3s内平均肌张力作为药前值；每次给予DOX后，记录药后第20min时3s内的平均肌张力作为药物的反应。实验设计

酚苄明对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入10-5mol•L-1的酚苄明，阻断α受体；酚苄明与标本作用10min后，用营养液反复冲洗标本7~8次，将营养液中的酚苄明冲洗干净；待标本平衡后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。实验数据的记录同前。

吲哚美辛对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入10-6mol•L-1吲哚美辛（环氧合酶抑制剂），抑制前列腺素（PG）合成；吲哚美辛与标本作用10min后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。

维拉帕米对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入5×10-6mol•L-1维拉帕米，阻断Ca2+通道；维拉帕米与标本作用10min后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。

亚甲蓝对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入10-5mol•L-1亚甲蓝（可溶性鸟苷酸环化酶抑制），抑制环鸟苷酸（cyclicguanosinemonophosphate，cGMP）生成；亚甲蓝与标本作用10min后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。

H-89对DOX对映体改变大鼠心房收缩力的影响标本刺激30min后加入10-6mol•L-1的H-89，抑制cAMP依赖性蛋白激酶（cyclicAMP-dependentproteinkinase，PKA）；H-89与标本作用10min后分别加入3、10、30μmol•L-1的(-)DOX或(+)DOX，每个标本只给予一种药物，溶剂对照组给予等体积蒸馏水。

实验数据以实测值和变化率的mean±SD或mean±SEM表示。同一药物不同浓度间的显著性检验采用单因素方差分析和Dunnett‘stest。两条浓度-反应量效曲线之间的比较，采用双因素方差分析，当F值有显著性（P<0.05）时，进一步采用Bonferroni’stest比较两对应点间的差异。统计学分析及图形处理均使用GraphPadPrism5.0软件。统计学处理结

果

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.71±29.36215.71±39.52235.71±71.61

3

214.29±46.14245.71±44.29195.71±58.27(-5.70±9.91)(15.57±20.95)△(-15.61±14.15)△10225.71±64.51314.29±90.34*145.71±69.97*(0.59±18.94)(46.96±39.77)△(-36.99±23.58)30218.57±43.37357.14±68.49**△△57.14±41.12**△△(-3.62±9.24)(67.46±30.09)△△(-57.48±56.01)△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheratisolatedleftatriumPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=7.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0225.33±24.37206.67±41.31215.00±25.103

219.26±38.42231.67±47.50200.00±64.19(-5.65±9.18)(13.02±16.66)(-8.02±21.43)10219.25±51.33305.00±37.82**△168.33±53.07(-2.19±15.67)(53.65±41.02)△△(-21.60±21.50)

30222.67±60.11338.33±64.01**△△81.67±59.47**△△(-4.67±8.66)(70.87±52.66)△△(-63.75±24.14)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithatropineandpropranololPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0223.28±37.25221.67±42.62211.67±42.623

213.75±38.54255.00±74.77175.00±46.80(-4.95)±12.18(13.71±14.39)(-14.08±23.48)10211.29±60.77300.00±64.19△131.67±39.20*△(-2.89±28.22)(35.48±11.90)△△(-33.08±17.85)△30219.27±55.05371.67±60.80**△△81.67±37.64**△△(-4.39±9.78)(71.62±37.20)△△(-60.73±17.21)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithphenoxybenzaminePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0237.52±27.22211.67±39.20210.00±36.883

220.00±36.44250.00±33.47188.33±49.56(-3.56)±9.18(19.05±7.14)(-10.40±14.76)10221.25±50..05315.00±80.68**△△161.67±69.40(-3.23±18.34)(49.27±28.71)

△△(-23.73±26.18)30229.00±60.09353.33±41.79**△△70.00±20.00**△△

(-7.23±8.87)(71.21±35.57)△△(-65.63±6.52)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithethanolPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△△P<0.01vscontrol.

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0216.67±35.02251.67±55.29246.67±46.763

220.00±38.99296.67±43.20△226.67±45.46(1.65±10.94)(19.87±13.06)△(-7.23±13.39)10218.33±31.88386.67±66.83**△△165.00±49.70*(1.10±6.54)(55.73±18.00)△△(-31.33±18.74)△△30206.67±38.30396.67±88.92**△△73.33±29.44**△△(–4.73±8.62)(60.25±35.25)△△(-70.42±8.90)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithindomethacinPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.

*P<0.05,**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

(-)DOX明显增强离体小鼠左心房肌条的收缩力，本研究中(-)DOX对大鼠离体左心房肌条的收缩力有同样的作用。(-)DOX增强大鼠心房肌收缩力的作用与α受体无关。此前也曾有文献报道DOX及哌唑嗪可诱导体外培养大鼠心肌细胞的凋亡，并且这种诱导作用与α受体阻断作用无关。心脏的M胆碱受体、β受体以及环氧合酶可能未参与(-)DOX的正性肌力作用。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0176.25±72.30141.25±41.55187.50±95.883162.50±70.05172.50±43.34162.5±71.26(-10.12±10.33)(24.81±20.49)△△(-9.60±17.19)10152.50±65.63248.75±79.54**△118.75±57.93(-14.51±7.16)(75.98±23.00)△△(-33.47±9.43)△30152.50±58.25323.75±87.82**△△45.00±19.27**△△(-13.53±8.35)(131.15±17.56)△△(-72.23±14.65)△△EffectsofdoxazosinenantiomersoncontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithverapamilPercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=8.

**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.

Ca2+拮抗剂维拉帕米预处理标本使大鼠左心房标本的心肌收缩力减弱，提示细胞外Ca2+内流以及细胞内Ca2+释放参与了大鼠左心房标本的心肌收缩反应。尽管30μmol•L-1(-)DOX对维拉帕米预处理大鼠心肌标本的收缩力增强百分比，显著强于其对正常且未经处理大鼠心肌标本的作用；但是，3、10和30μmol•L-1(-)DOX诱发两种不同处理标本的正性肌力作用分别为（172.50±43.34mg）、（248.75±79.54mg）、（323.75±87.82mg）和（245.71±44.29mg）、（314.29±90.34mg）、（357.14±68.49mg）。因此，我们认为维拉帕米对(-)DOX的正性肌力作用有一定的拮抗效应；但是随着(-)DOX浓度升高，维拉帕米的拮抗效应逐渐减弱甚至消失，具体机制尚待进一步研究。

ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0215.00±32.71223.33±36.15241.67±77.313

210.00±34.06303.33±45.90△△218.33±45.35(-1.18±11.57)(36.26±9.82)△△(-5.57±17.32)10208.33±21.37373.33±98.52**△△211.67±87.50(-2.14±10.34)(65.99±26.27)△△(-10.54±25.09)30201.67±24.01260.00±97.7898.33±49.56**△(-5.42±9.52)(16.02±35.33)(-58.27±15.47)△△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithmethylenebluePercentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.亚甲蓝预处理标本后，低浓度(-)DOX的正性肌力作用有增强趋势；但是最高浓度(-)DOX的正性肌力作用受到显著抑制。该研究结果提示细胞内cGMP可能在某种程度上参与了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。ConcentrationContractileforce(mg)(μmol·L-1)Control(-)Doxazosin(+)Doxazosin0221.67±51.54261.43±67.18208.33±64.013

218.33±47.08338.57±96.86△178.33±78.34(-0.93±6.21)(28.96±9.49)△△(-17.71±16.37)10203.33±43.20471.43±107.61**△△153.33±75.28(-7.01±4.22)(81.93±20.75)△△(-30.76±18.38)△30216.67±43.20520.00±103.44**△△73.33±33.27**△△(-0.30±9.38)(101.53±51.95)△△(-64.67±10.74)△EffectsofdoxazosinenantiomersonthecontractileforceintheisolatedratleftatriumpretreatedwithH-89Percentageofchangeisindicatedinparenthesis.Datawereexpressedasmean±SD,n=6.**P<0.01vsbeforedrug;△P<0.05,△△P<0.01vscontrol.小结

(-)DOX增强大鼠心房肌收缩力的作用，可能与心肌α受体、M胆碱受体、β受体以及环氧合酶无关；L型Ca2+通道、细胞内cGMP以及PKA可能在某种程度上参与了(-)DOX在大鼠左心房的正性肌力作用。但是，心肌α受体、M胆碱受体、β受体、Ca2+通道、环氧合酶、cGMP及PKA，可能未参与(+)DOX对大鼠左心房的负性肌力作用。第三部分

多沙唑嗪对映体在大鼠、犬和人血浆中的蛋白结合率研究

血浆蛋白结合在药物治疗中起着重要的作用。药物与血浆蛋白结合的变化显著影响其药代动力学和药效学。对映体蛋白结合的立体选择性研究是明确其药理学效应、临床疗效及安全性必不可少的内容。因此，有必要对多沙唑嗪对映体蛋白结合的立体选择性进行研究。本研究采用平衡透析法利用卵粘蛋白手性色谱柱同时测定大鼠、犬和人血浆中多沙唑嗪对映体的浓度，并计算其蛋白结合率。Agilent1260液相色谱系统（荧光检测器，四元泵，自动进样器）色谱柱:UltronES-OVM手性柱(150mm×4.6mmi.d.,5µm,Shinwa,Japan)流动相:

磷酸盐缓冲液(20mM,pH5.32)-乙腈(86:14v/v)流速:1.0mL/min柱温:30°C检测光谱:激发波长255nm，发射波长385nm哌唑嗪,(-)DOX和(+)DOX保留时间分别为6.2min,10.0min及11.3min.色谱条件血浆蛋白浓度分析BCA

蛋白含量检测试剂盒(MultisciencesBiotechCo.Ltd,Hangzhou,China)分析混和血浆蛋白浓度.试管中加入50ul稀释血浆(稀释100倍）及Bradford试剂(1.5mL)，37°C震荡混匀。

TU-1901UV-VIS紫外分光光度计在562nm处测吸光度。以BSA制作标准曲线测定样品的蛋白浓度。蛋白结合研究

平衡透析过程依照说明书准备半透膜：煮沸去离子水浸泡20min,30%乙醇浸泡20min.去离子水冲洗,PBS浸泡60min.500ul血浆置于2cm长半透膜透析袋中，两端结扎，透析袋放入5mL试管（内含200,400or800ng•mL-1(±)DOX的PBS缓冲液3mL）.密闭，37°C温育15h.HPLC法测定透析袋内及试管内药物浓度（各取5份样品）。PBS缓冲液样品处理

取400µL透析液加入20-μL内标溶液(prazosin1µg•mL-1)加入900µL正己烷－乙酸乙酯(1:1,v/v).涡旋2min,6000rpm离心4min.取上清移入另一试管，氮气流吹干200µL流动相复溶.取10µL进样分析，检测游离药物浓度透析袋内样品处理

取100µL透析袋内容加入20μL内标溶液(prazosin2µg•mL-1)及900µL正己烷

－乙酸乙酯涡旋2min,6000rpm离心4min.取上清移入另一试管，氮气流吹干200µL流动相复溶.取10µL进样分析，检测总药物浓度结

果

采用高效液相色谱法手性分离血浆及PBS中的(±)DOX，专属性良好，内标（哌唑嗪）、(-)DOX和(+)DOX达到基线分离，最低检测