majun-基因工程-分子基本操作技术

第四章分子基本操作技术生物科学与技术学院核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的真核生物95%的DNA存在于细胞核内，5%的DNA在细胞器75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器其中rRNA（80～85%）tRNA及核内小分子RNA（10～15%）mRNA（1～5%）第一节DNA的基本操作技术DNA提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染DNA提取的几种方法1、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它2、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取，包括碱裂解法和煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取，主要是差速离心结合SDS裂解法基因组DNA－CTAB法

CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/LNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。注：CTAB溶液在低于15℃

时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl（pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

CTAB法流程图植物材料裂解液上层溶液液氮研磨抽提细胞裂解干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－SDS法

SDS法原理SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。SDS法流程图

（以动物组织为例）

动物组织细胞裂解上层溶液组织匀浆抽提干燥溶解离心洗涤酒精沉淀DNA溶液基因组DNA－其它方法物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法生物方式：酶法

根据细胞裂解方式的不同有：吸附材料结合法：

根据核酸分离纯化方式的不同有：硅质材料阴离子交换树脂磁珠

高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的实验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而达到分离目的。质粒DNA－碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。碱裂解法流程图对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁核酸分离、纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaOAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取基因组DNA的检测

提取的基因组DNA片段在20kb－30kb之间高质量的基因组DNA带型单一无拖尾现象DNA浓度及纯度的检测A260=1约50μg/mL双链DNA；

A260/280约为1.8DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留

原因对策重新纯化DNA，过吸附柱去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）加入RNase降解RNA问题二：DNA降解。材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融

原因对策尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融问题三：DNA提取量少。实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失

原因对策尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁。高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）。增加吸附的时间，或低温沉淀小心操作第二节RNA基本操作技术分离提纯RNA的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物RNA的不稳定性核糖残基的2’和3’位置带有羟基，RNA易于被RNA酶切割水解

RNA酶含量丰富，加热后仍能够正确折叠恢复活性，不易失活提取RNA的注意事项经常更换新手套。因为皮肤和实验室用品上可能有RNase，会导致RNase污染。使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染。应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5MNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。常用RNA酶抑制剂焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。异硫氰酸胍：目前是最有效的RNA酶抑制剂，裂解组织的同时也使RNA酶失活。既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。RNA提取的步骤材料的裂解杂质的去除RNA的吸附或沉淀异硫氰酸胍，亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。苯酚，氯仿，异戊醇抽提去除杂物，使DNA及蛋白沉淀到有机相。硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩RNA。经DEPC处理的水溶解RNA材料准备及裂解尽量使用新鲜材料，植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位，现取现提。组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清，消化系统的组织选取杂质少的部位,细菌和酵母需要匀浆处理。对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻，或投入专门的RNA样品储存液中保存。液氮研磨时不要使液氮挥发净，随时补充；加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。杂质的抽提采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间，使蛋白质、多糖和DNA分布到中间层和有机相中，RNA留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层，可以再次用有机溶剂抽提RNA的沉淀和溶解含RNA的水相过吸附柱，通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀RNA应充分的混匀并放置10min左右离心收集沉淀，70％乙醇洗涤，晾干用经DEPC处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解RNA样品收集后或需长期保存时应置于－70℃或加入RNase抑制剂，分装使用RNA的检测电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RNA纯度及浓度的检测（A260=1，约40μg/mLRNA；

A260/A280

约为1.9-2.1）RNA提取常见问题1抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染2DNA的污染

3离子浓度较高

原因对策1保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心；增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化2减少处理样品的量；加入不含RNase的DNase处理；再次纯化3增加漂洗次数问题一：RNA样品不纯1样品含有杂质杂液2样品过量或样品裂解和匀浆不彻底3RNA未有效的吸附沉淀或洗脱4样品RNA含量少

原因对策1去除样品中的杂质，