X专题课题酵母细胞的固定化

温故知新：1、洗衣粉中添加________，可以更有效地清除顽渍。常用的酶制剂有_________________四类。2、影响酶活性的因素有_______、________和_________。在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。课题3

酵母细胞的固定化课题背景问1：酶已经应用于哪些方面，酶制剂有哪些优点？人们发现哪些实际问题？

如今，酶已经大规模地应用于食品、化工、轻纺、医药等各个领域。优点：催化效率高、低能耗、低污染等

于是，有人设想，将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。现代的固定化酶技术已完全实现了这一设想。高果糖浆的生产就是固定化酶技术成功地应用于工业生产的实例。

课题3

酵母细胞的固定化问2：面对这些实际问题，你有什么设想？课题背景酶是由细胞合成的，于是，又有人设想，能否将合成酶的细胞直接固定?自20世纪70年代，在固定化酶技术的基础上，又发展出了细胞固定化技术。与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。在本课题中，我们就来学习酵母细胞的固定化，了解固定化酶的作用。课题3

酵母细胞的固定化问3：面对这些实际问题，进一步的设想与创新？课题背景阅读与思考（P49~50）1、什么是高果糖浆？与蔗糖比有何优点？2、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？3、这种酶在应用中有什么不足？解决的技术是？4、高果糖浆生产过程？5、这种方法的优点是什么？基础知识

(一)固定化酶的应用实例1、高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康更有益。2、生产高果糖浆需要葡萄糖异构酶；其作用是将葡萄糖转化为果糖；这种酶稳定性好，可持续发挥作用。3、酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。固定化酶技术。基础知识

(一)、固定化酶的应用实例问1、什么是高果糖浆？与蔗糖比有何优点？（食品生产为什么偏向用果糖不用蔗糖？）问3、这种酶在应用中有什么不足？解决的技术是？问2、生产高果糖浆需什么酶？作用是什么？这种酶有何特点？使用固定化酶技术，将葡萄糖异构酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触转化成果糖，从反应柱的下端流出基础知识

(一)、固定化酶的应用实例问4、高果糖浆生产过程？5优点是：（1）使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；（2）固定在载体上的酶可以被反复利用。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。基础知识

(一)固定化酶的应用实例问5、这种方法的优点是什么？问：在生产实际中使用固定化酶技术有无不足？如有不足，怎么办?有。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实际中很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能进行，所以操作比较麻烦。可采用固定化细胞技术。基础知识（二）固定化细胞技术问：固定化酶或固定化细胞的定义及方法？固定化技术的定义及方法：固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法(将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上)和物理吸附法。2.将酶或细胞固定化的方法将酶（或细胞）包埋在细微网格里将酶（或细胞）相互连接起来将酶（或细胞）吸附在载体表面上包埋法化学结合法物理吸附法酶和细胞固定方法的选择①酶适合采用化学结合和物理吸附法固定②细胞适合采用包埋法固定（1）、方法（2）、原因①细胞个大，酶分子很小②个体大的细胞难以被吸附或结合而个小的酶容易从包埋的材料中漏出基础知识（二）固定化细胞技术问：固定化酶和固定化细胞常用的载体材料？

本课题使用的是包埋法固定化细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。本实验选用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞。1、从操作角度来考虑，你认为哪一种方法更容易?2、哪一种方法对酶活性的影响更小?3、固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶?4、如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法?5、如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法?实验操作（一）制备固定化酵母细胞阅读P50~51思考下列问题：（1）、制备过程包括哪几个步骤？（2）、你认为哪个步骤的操作是最重要的一环？（3）、各步骤应当分别注意什么问题？1．酵母细胞的活化2．配制物质的量浓度为0.05mol／L的CaCl2溶液

3．配制海藻酸钠溶液4．海藻酸钠溶液与酵母细胞混合

5．固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化问：什么是活化？怎样活化？应注意什么？实验操作（一）制备固定化酵母细胞取1g干酵母，放入50ml的小烧杯中，加入蒸馏水10ml，用玻璃棒搅拌，使酵母细胞混合均匀，成糊状，放置1h左右使其活化。活化：就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态注意事项A、选用的干酵母要具有较强的活性，而且物种单一B、在缺水状态下，微生物处于休眠状态。注意水的用量活化：让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态；本质：加快新陈代谢；方法：加入适量的水。

实验操作2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液称取无水CaCl20.83g。放人200mL的烧杯中，加入150mL的蒸馏水，使其充分溶解，待用。注意事项溶解物质要彻底，勿用自来水溶解，以防自来水中各种离子影响实验结果（一）制备固定化酵母细胞3、配制海藻酸钠溶液实验操作（一）制备固定化酵母细胞称取0.7g海藻酸钠，放入50mL小烧杯中，加人10mL水，用酒精灯加热，边加热边搅拌，将海藻酸钠调成糊状，直至完全溶化，用蒸馏水定容至10mL。注意，加热时要用小火，或者间断加热，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止。说明：海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。4、海藻酸钠溶液与酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的酵母细胞，进行充分搅拌，使其混台均匀，再转移至注射器中实验操作（一）制备固定化酵母细胞注意事项

A、溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，否则会因温度过高杀死酵母菌B、搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察实验操作5、固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，观察液滴在CaCl2溶液中形成凝胶珠的情形。将这些凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右如果没有注射器，可以在小塑料瓶上安装一个孔径为2mm的喷嘴来使用。（一）制备固定化酵母细胞注意事项A、可利用海藻酸钠制成不含酵母菌的凝胶珠，用作对照B、海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，需稳定30min左右（二）用固定化细胞发酵

1、将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。实验操作（一）制备固定化酵母细胞

2、将150mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到200mL的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h。注意事项①控制好发酵温度，一般是室温25℃②发酵时间可视具体情况而定，一般时间稍长一些，效果明显③可用不含酵母的凝胶珠做相同的处理，对照实验结果海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解。溶解海藻酸钠，最好采用小火间断加热的方法。例如，加热几分钟后，从石棉网上取下烧杯冷却片刻，并不断搅拌，再将烧杯放回石棉网继续加热，如此重复数次，直至海藻酸钠完全溶化。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。操作提示（一）观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。（二）观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。1．观察并描述形成的凝胶珠的颜色和形状。2．观察利用固定化酵母细胞发酵的葡萄糖溶液，看看是否有气泡产生，闻闻是否有酒味。结果分析与评价刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。

检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，