分子标记及基因芯片技术应用

分子标记及其在植物遗传育种中的应用遗传标记（geneticmarker）具有多型性易于鉴别与目标基因紧密连锁

性状标记

色泽，形态…

细胞学标记

倒位，易位，G/N/C带…

生化标记

同功酶…

分子标记RFLP、RAPD、SSR、AFLP、SNP……基础-基因表达结果表现型DNA碱基序列变异形态标记遗传学上稳定、可见的外部特征---遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。细胞学标记染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型（C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。

生化标记——贮藏蛋白和同工酶贮藏蛋白同工酶特点：经济、方便、成本较低结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。分子标记本质是以核苷酸序列作为标记，一般特点：（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。分子标记的分类（Staub等1996）分子标记以Southern为基础如RFLP以PCR为基础单引物PCR标记有RAPD、

AP-PCR、DAF、ISSR等双引物选择性扩增PCR主要指AFLP需克隆、测序构建特殊双引物PCR标记 如SSR、STS等植物遗传研究中常用的分子标记RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs

(DAF,AP-PCR)SSR—SimpleSequenceRepeatAFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphismRFLP原理：DNA限制性内切酶酶切电泳转移到硝酸纤维素滤膜同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交胶片放射自显影，显示酶切片段大小酶切：3-5ugDNA，以10U内切酶酶切5小时电泳：0.6-0.8%琼脂糖胶70V电泳16小时染色：EtBr染色20分钟变性：0.25MHCl20分钟，抽真空，水冼印迹：加入0.4NNaOH，进行Southern印迹冲洗：以2×SSC冼胶，风干酶切—电泳—印迹—杂交—洗脱预杂交：将杂交膜放人预杂交液（水、5×HSB、DenhardtⅢ）中，封好后置65℃温箱中振荡5－6小时。杂交：预杂交液中加入标记好的marker和探针，放入杂交膜浸匀。封好杂交盒后，置65℃温箱中振荡过夜。洗脱：将膜转入洗脱盒，加入洗脱液65℃振荡洗脱两次（15min/次），吸干包好。—放射自显影将洗脱好的杂交膜置于增感屏上,于暗室中将X-光片放于杂交膜上，再放上另一张增感屏，装人暗袋，并用夹板夹好。置-70℃超低温冰箱中曝光10天左右。使用磷屏仪，操作更方便。RFLP探针来源：cDNA探针与基因组DNA（gDNA）探针cDNA探针:保守性较强，探针检测的多态性频率较低。gDNA探针:检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强。玉米RFLP探针：http:///probes.Html探针标记—随机引物法25ng变性DNA5ul

寡聚核苷酸2ulBSA3ul[α-32P]dCTP2ul

Klenow酶加水至50ul，37℃温箱中标记2小时RFLP标记特点共显性，可以区别纯合和杂合基因型稳定、重复性强某些植物中开发探针已遍及整个基因组缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；

在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。RAPD原理：用一个随机引物（8-10bp）、碱基随机排列的寡核苷酸序列，非定点地扩增基因组DNA，然后电泳分开扩增片段。PolymeraseChainReaction-PCR3'5'5'3'TargetDNAsequenceGCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGdenature@95˚C5'3'3'5'GCTCGCAGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCannealprimers@60˚CTaqpolymerasebinds3’andextendsGCTCGC5'3'3'5'AGTACTTCATGACGAGCGTCATGAGCTCGCDNAisdoubledwitheachcycleRepeat25-40timesRAPD的操作PCR反应：DNA（20ng/µl） 1µlPrimer 15ng10×Buffer 2.0µlMg2+（25mM） 1.2µl

Taq酶（5U/µl） 0.15µldNTP（25mM） 0.2µl加水至20µl，再加入石腊油，进行PCR扩增Step195℃2分钟Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循环Step6

72℃5分钟

PCR扩增：主要特点无需杂交，设计引物也无须知道序列信息；DNA需要量少，引物便宜，成本较低；技术简便，操作方便、快速，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术。不同物种间引物通用；缺点：大多显性遗传，不能鉴别杂合和纯合子；实验重复性较差，结果可靠性较低。DAF

(DNAamplificationfingerprinting)：与RAPD不同的是:引物浓度更高，引物长度更短（一般5－8个碱基），且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳，通常会产生非常复杂的带型，谱带信息比RAPDs大得多。（Caetano-Anolles等，1990）AP-PCR(arbitrarilyprimedpolymerasechainreaction)引物较长（10～50bp）；引物浓度较高；引物长度不定，并且常常来自为其它目的而设计的引物（如M13通用测序引物）。ISSR共同优点：

在不需要知道所扩增DNA序列情况下，产生DNA片段的指纹；需DNA量少，产生多态性丰富。缺点：

对反应条件非常敏感，重复性差。SCARs

（SequencedCharacterizedAmplifiedRegions）为提高RAPD标记稳定性，把目标RAPD片段克隆测序，根据片段两末端的序列设计特定引物（通常24个碱基），再进行PCR扩增，可把相应的单一位点鉴定出来。具有更高的可重复性共显性微卫星标记(SSR)真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在一个SSR.哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNASSR数量多于细胞质DNA;根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱基等多种重复型。不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。SSR的分布特点SSR的功能长期以来一直认为SSR是转录哑区，没有明确的生理功能。但随着研究深入，证明并非如此。SSR的主要功能:

编码氨基酸；染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能；提高或降低临近基因转录速率；基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。SSR分析SSR分子标记的创制基因组文库的构建探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择测序引物设计检测其它方法:EST-SSR、相关种间SSR......Cross-speciesSSRTaxonomic Transferability Polymorphism

Divergence%(N)%(N)Samesubgenus 89.8(521) 78.3(299)Samegenus 76.4(1800) 86.0(773)Samealliance 45.4(403) 50.4(141)Samefamily 35.2(1683) 58.4(363)SSR的操作PCR反应：DNA（20ng/µl） 4µlPrimer（1mM） 0.25µl10×Buffer 2.0µlMg2+（25mM） 1.2µlTaq酶（5U/µl） 0.1µldNTP（25mM） 0.2µl加水至20µl混合后，进行PCR扩增：Step1 95℃2分钟Step2 95℃30秒Step3 56℃30秒Step4 72℃60秒Step5 GOTOStep231循环注：SSR引物退火温度在52-65℃不等。SSR的特点：两侧顺序保守，在同种间多相同；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；实验重复性好，结果可靠；多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；仅需微量组织，适合PCR分析半自动化相对的物种专一性；由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。不足：SSR的检测琼脂糖凝胶检测（同前）聚丙烯酰胺凝胶检测一般采用银染、荧光检测。银染检测程序脱色：加1升10%HAC液，脱色20分钟冲洗：用重蒸水冲洗胶板2次，每次5分钟染色：加染色液(1%AgNO3，0.075%甲醛)30分钟冲洗：用重蒸水冲洗胶板不超过5秒钟；显影：预冷显影液（30g/LNaCO3，0.075%甲醛，0.4mg/mlNa2SO3），轻摇到带纹出现；定影：在固定/停止液并轻摇3-5分钟；冲洗：用重蒸水冲洗2次，每次2分钟；干胶：室温下自然干燥过夜。AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism)原理：基于RFLP技术和PCR技术的结合

DNAMseI-MseI

MseI-EcoRI

EcoRI-EcoRIMseI-MseI片段环化，不利小片段扩增；EcoRI-EcoRI

引物的退火温度高；MseI-EcoRI

片段优先扩增酶切连接接头序列MseⅠ接头、PstⅠ分别为：MseⅠ：

5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’3’-TACTCAGGACTCAT-5’PstⅠ：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’EcoRⅠ：

5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’3’-CTGACGCATGGTTAA-5’

M00:5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3'；P00:5'-

GACTGCGTACCAATTC-3';E00:5'-GACTGCGTACCAATTC-3';MseI-primers+3:5'-GATGAGTCCTGAGTAANNN-3‘EcoRI-primers+3:5'-GACTGCGTACCAATTCNNN-3‘PstI-primers+3:5'-GACTGCGTACATCGAGNNN-3‘

AFLP技术的特点（1）由于内切酶及选择性碱基组合数和种类很多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。（2）多态性远远超过其它分子标记，一般可检测到50-100个AFLP扩增产物，能够在遗传关系十分相近的材料产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。（3）AFLP分析由于扩增片段较短（30-700bp)，分辨率高。（4）AFLP分析用样量少（0.05-0.5gDNA），而且对模板浓度的变化不敏感。（5）由于特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性高。（6）引物在不同物种间是通用的，可用于没有任何分子生物学研究基础的物种。（7）银染技术具有快速、方便的特点，在1-2天内可以得到指纹。AFLP操作具体包括三个步骤：1.

酶切--连接；2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.5～1μg；3.

电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增—预扩增和选择性扩增。AFLP操作步骤：模板DNA的酶切与连接DNA（200ng/µl） 2.5µlMseⅠ 3单位PstⅠ 3单位MseⅠ接头（50pmol/µl） 1.0µlPstⅠ接头（5pmol/µl） 1.0µl10×NEBBuffer 2.5µl100×BSA 0.25µlATP（10mM） 2.0µlT4-连接酶（3U/µl） 0.4µl加水至25µl，37℃酶切-连接4-6小时，或过夜。

AFLP实验程序DNA片段的预扩增取2.0µl完成的样品，加入18µl如下混合液：

MseⅠ引物（M00，50ng/µl）0.6µl

PstⅠ引物（P00，50ng/µl）0.6µl10×PCRBuffer 2.0µlMg2+（25mM） 1.2µl

Taq酶（5U/µl） 0.1µldNTP（25mM） 0.16µl加ddH2O至20µl

混合后，在如下PCR条件下扩增：Step1 95℃2分钟Step2 95℃30秒Step3 56℃30秒Step4 72℃60秒Step5 GOTOStep231cyclesStep6 72℃5分钟AFLP的选择性扩增取4µl稀释预扩增液，加入16µl如下反应液：PstⅠ引物（50ng/µl） 0.8µlMseⅠ引物（50ng/µl）0.8µl10×PCRBuffer 2.0µlMg2+（30mM） 1.1µldNTP（25mM） 0.18µlTaq酶（5U/µl） 0.12µlddH2O 11.0µl混合后按如下PCR程序扩增：

Step1 95℃2分钟

Step2 95℃30秒

Step3 65℃30秒（-0.7℃/cycle）

Step4 72℃60秒

Step5 GOTOStep212循环

Step6 95℃30秒

Step7 56℃30秒

Step8 72℃60秒

Step9 GOTOStep630cyclesStep10 72℃5分钟AFLP的检测银染荧光同位素检测注意事项：1．AFLP酶切反应对模板DNA质量要求较高，要求260/280在1.8左右，且不能有降解。2．AFLP反应对模板DNA浓度不是很敏感，在50pg-50ng时，均可以观察到多态性带，但为了实验的准确性，DNA浓度不能太低。3．酶切-连接反应可以分开作，也可以合在一起作，但合在一起更方便些。4．AFLP反应对PCR要求较高，要首先摸索优化Mg2+、dNTP条件，达到最佳扩增。5．EcoRⅠ受甲基化胞嘧啶的影响较小，而PstⅠ对富含的甲基化胞嘧啶十分敏感，因而PstⅠ-MseⅠ检测的多为表达区域，而EcoRⅠ-MseⅠ检测位点聚集在甲基化较高的重复序列区域。6．引物中用作选择性核苷酸的Ｇ和Ｃ含量对扩增出的产物数目有影响。一般而言，Ｇ和Ｃ含量越高，扩增出的产物数目越少。7．同位素、荧光标记分辨率较高，但价格昂贵，操作不方便；银染方法方便快捷，掌握好各个环节，同样可以达到很好的效果。为什么用双酶解?适合PCR扩增效率与变性胶的分辨率减少PCR扩增的片段,从而减少使用选择性碱基的数目使标记单链成为可能增加PCR扩增的灵活性增加使用引物的灵活性为什么要预扩增?减少选择性碱基的错配减轻背景提供足量模板DNA降低模板浓度的影响目的：分子标记辅助选择(MAS)筛选BAC文库，进行图位克隆（map-basedgenecloning）AFLPSCARPIC/Simpson遗传多样性系数=1-Pi2等位基因数目A

A=4PIC=1–SUM(0.47)2+(0.30)2+(0.17)2+(0.04)2=0.64SSR资料：遗传相似系数Gower(1985):

a+da+b+c+d简单匹配系数（SM）(Simplematchingcoefficient)

aa+b+cJaccard

相似系数(Jaccard1908).

2a2a+b+cDice(1945)相似系数，即

Nei&Li(1979)相似系数.其中:abcd+

-+-kj遗传距离的计算：Rogers（1972）Rogers-W（RogersdistanceasmodifiedbyWright（1978）两个随机群体j、k间的遗传距离（Nei1972）:

Xij

为X群体第i个位点第j个等位基因频率

Yij为Y群体第i个位点第j个位点基因频率

在种质资源研究中，大多数采用罗杰斯距离（RD）和改良的罗杰斯距离（MRD）（Rogers，1972；Goodman&Stuber，1983）。根据遗传特性确定的罗杰斯距离在相关种质的亲缘关系分析中非常有用；而改良的罗杰斯距离还适用于杂种优势研究。

聚类分析聚类指标：遗传相似系数遗传距离聚类方法：SAHN（SequentialAgglomerativeHierarchicalandNested）clustering

常用UPGMA分析软件：NTSYS-pc2.02（Rholf，1998）QTL分析单标记作图法；区间作图法；Mapmaker/QTLhttp://www-/genome_software

复合区间作图法；Cartographer、QTLmapperhttp:///qtlcart/WQTLCart.htmhttp:///ics/faculty/zhujun.htm‘A’HomozygotefortheallelefromAparent‘B’HomozygotefortheallelefromBparent‘H’HeterozygotecarryingbothalellesAandB‘C’EitherBBorABgenotype‘D’EitherAAorABgenotype‘-’MissingdatafortheindividualatthislocusdatatypeF2intercross2051*locus1BBBHH-AAABBBHHH-AABA*locus2AB-ABHABHAB-AB-ABHAH*locus3ABBAHHHBHABHABHBBHH-#Locus3maybemis-scoredinindividual12!*locus4ABHHABAAAHAB-ABHABHH*locus5ABHABHAA-ABHABHAHHHB*trait8.79.0-7.56.8EST(ExpressedSequenceTags)SNP（singlenucleotidepolymophism）cSSR、cSNPDNA微阵列（Microarray）蛋白质组学．．．．．．新型分子标记EST是长约150-400bp的基因表达序列片段，携带着完整基因的某些片段。

mRNA反转录成cDNA，克隆到质粒或噬菌体载体，构建cDNA文库，而后大规模随机挑选克隆，对5’或3’端进行一步法测序，获得对生长发育、遗传变异、衰老死亡等过程认识的技术。EST(ExpressedSequenceTags)DNADatabankscDNAresourcesGenbank(NCBI),NucleotideSequenceDatabase(EMBL),DDBJ,MGC,…GenomicDNAresourcesHTG,dbGSS,GOLD,ERGO,…ESTresourcesdbEST,UniGene,GIs,STACKS,DOTS,…OthersdbSTS,UniSTS,dbSNP,TransFac,ISIS,Repbase,......常用基因组网址：拟南芥:TheArabidopsisInformationResource(TAIR)

/水稻：RiceGene

http:///大豆：SoyBase

4/玉米：MaizeDB,MaizeGDBhttp:///小麦：GrainGene

http:///棉花:CottonDB

/htdocs-cotton/cottondb.html苜菽：Alfagenes

http:///大麦：BarleyDB--http:///barley.html油菜：BrassicaDB

Http:///brassica.html高梁：SorghumDbhttp:///sorghumdb.html单核苷酸多态（SNP

-singlenucleotidepolymophism）SNP是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态，即基因中的点突变。特点：双等位基因在基因组中的发生频率比较高有些SNP位点还影响基因的功能

SNPs可大大丰富既有的连锁图成熟自动化技术，有望分析成千上万的SNPs

cSSR、cSNP———从EST中开发SSR、SNP目前某些植物全序列的测定及EST数据库的开发，为SSR、SNP的开发开辟了新的途径。优点：表达序列，与特定功能有联系多态性丰富，可大大丰富标记数目开发简单、经济利用DNA芯片技术，将大量探针固定于玻/硅片上，然后用荧光标记样品进行大量分子杂交，以比较不同组织或器官的基因表达水平，筛选突变基因，分析基因表达模式。

优点：密度高、制作方便，解决了传统核酸杂交技术复杂、自动化程度低、检测目的分子数量少、低通量等不足DNA微阵列（Microarray）微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待检样品用量自动化—提高工作效率低成本—可迅速普及推广生物芯片的特征与优点蛋白质组学为基础的分子标记蛋白质是基因表达的产物,是基因功能的执行体，决定了生物的生长、发育、繁殖等各种性状。蛋白质组研究---了解生物体蛋白质表达的时空分布规律,不同个体/组织间的表达差异蛋白质分子标记---定位生物的表性变异(如抗病、抗逆等性状)和相关基因Thekeytechniqueinvolvesinproteomics1.Massspectrometry2.Two-dimensionalgelelectrophoresis3.Yeasttwo-hybridsystem分子标记技术

在植物遗传研究中的应用利用遗传图和遗传标记可用来加速植物育种进程。经典遗传图谱：形态、生理和生化标记，数量极为有限，图谱分辨率大都很低，表现标记少，图距大，饱和度低。分子标记技术的发展，使图谱上标记的密度越来越高。植物基因组遗传作图构建遗传图谱（molecularmarkerlinkagemap）以具有遗传多型性的分子标记为“路标”Polymorphicmolecularmarkeras“routesign”以减数分裂中发生的遗传重组交换值为图距Recombinationfrequency(%)inmeiosisas“mapdistance(cM)”绘制高密度的分子标记连锁图GeneticlinkagemapwithhighdensityQTL作图所需的数据遗传标记数据数量性状数据分子标记连锁图谱的构建

定位群体亲本间多态性分子标记的筛选定位群体的组建

定位群体分子标记分析分子标记连锁图谱的绘制利用3个分离群体，一个人，三个月时间，能完成包括1032个AFLP标记的遗传连锁图谱（Faye等1995）。AFLP不仅能缩小抗病基因与连锁标记之间的距离，而且在RFLP遗传图上，可增加染色体末端标记和填充RFLP空隙，不干扰RFLP标记簇，从而大大增加了遗传图的饱和度。在植物遗传多样性研究上的应用对植物种质资源遗传多样性的全面了解，对于拓宽遗传基础的育种策略十分重要。eg.贾继增等（1997）利用21条染色体上473个RFLP探针对小麦遗传多样性分析发现，小麦不同位点、不同染色体上的遗传多样性各不相同，普通小麦B基因组遗传多样性较高，其中尤以2B、6B、7B更高，而D组的遗传多样性最差。对在小麦育种中引进新的遗传变异具有一定的意义。

eg.通过288个位点上对338个一粒小麦系群AFLP指纹分析，结合种系分析，发现来源于土耳其东南部Karacadag山脉的一个野生一粒小麦（T.boeoticum）群体与栽培一粒小麦（T.monococcum

）遗传上最为相近，从而推断该地区为现代栽培一粒小麦的发源地（Heun等1998）。植物起源、分类和进化研究品种的DNA指纹图谱

定义：能够鉴定作物品种之间差异的电泳图谱。特点：高度的个体特异性、环境的稳定性及丰富的多态性。用途：鉴定品种真实性和纯度，用于新品种登记和品种知识产权保护等。其中AFLP被推荐为指纹图谱绘制的最佳方法之一。eg.Law等（1998）利用6个AFLP引物组合产生90多条多态性条带，建立了英国1934-1994广泛种植的55份小麦的指纹图谱。基因定位

质量性状的基因定位

近等基因系（NearIsogenicLines,NILs）NILs几乎仅在目标性状上存有差异，一般凡是能在近等基因系间揭示多态性的分子标记，就极可能位于目标基因的两翼附近。利用NILs方法已定位了许多质量性状基因，eg.番茄抗病毒基因Tm-2a，番茄抗细菌病毒基因及水稻半矮杆基因Sdy等。原理：将分离群体(F2、BC、DH）中的个体依据目标性状(如抗病、感病)分成两组，在每一组中将若干个体DNA等量混合，形成两个DNA混合池(如抗病池和感病池)。由于分组时仅对目标性状进行选择，因此两个池之间理论上就应主要在目标基因区段存有差异，也称近等基因池法。优点：克服了许多作物没有或难以创造相应NILs的限制(Michelmore等1991)。定位基因：莴苣抗霜霉病基因、水稻抗瘿蠓基因水稻抗稻瘟病基因、水稻耐黄丛卷叶病毒病基因等分离群体分组分析法(BulkedSegregationAnalysis)产量、品质、熟期等大多数重要农艺性状，均表现数量性状的遗传特点，受许多数量基因座位（QuantitativeTraitLoci,QTLs）和环境因子的共同作用。数量遗传学无法确定控制数量性状的QTLs数目，也无法确定单个QTL的遗传效应及染色体位置。分子连锁图谱的发展，可以实现对单个QTL遗传效应的追踪，从而应用于分子标记辅助选择。目前已发展了QTLs定位的多种方法。数量性状基因的定位基于图谱的基因克隆

谁最先了解基因的功能，谁就拥有了该基因的知识产权，也就获得了更多的利润。

克隆基因途径——正向遗传学和反向遗传学。前者以欲克隆基因的功能为基础，通过鉴定其产物或某种表型的突变进行；后者则着眼于基因本身，通过其特定的序列或其在基因组中的特定位置进行。图位克隆条件：(1)目标基因附近紧密连锁的DNA标记；(2)知道这些标记与目的基因的位置一旦建立与目的基因紧密连锁的分子标记图，就可以找到染色体步行的起始点，从而进行定位克隆。比较基因组研究

利用相同的DNA分子标记（主要是cDNA标记和基因克隆）在相关物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上的基因及其排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因组结构和起源进化进行分析。新发现：不同物种之间在标记探针的同源性、拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。eg

番茄、马铃薯和辣椒（Tanksley等1988；1992）；水稻、小麦和玉米（Ahn等，1993；1994）；小麦、大麦和黑麦（Devos等，1993）；高粱和玉米（Pereira等，1994）；以及大麦和水稻（Maroof等，1996）．．．．．．比较基因组学研究表明，不同物种之间在标记探针的同源性，拷贝数及连锁顺序上都具有很大程度的保守性。启示：模式植物上遗传作图成果可推而广之。可借助比较基因组共享分子标记，使建立高密度遗传连锁图可资利用的标记显著增加，从而大大提高了获取离目标基因很近分子标记的的可能性。应用比较基因组学进行基因的克隆绿色革命Rht1、Rht2基因的克隆拟南芥GAI水稻EST筛选小麦BAC文库Rht1、Rht2Blast探针标记深远意义比较基因组研究已使得传统的植物遗传学突破了物种的框架限定，发展成了新的系统遗传学。随着最近一些生物的基因组全序列的获得，比较基因组研究也随之步入了一个新的时代。研究基因表达与调控传统方法是利用cDNA文库筛选和Northern杂交。AFLP研究基因表达是非常有效的方法，可同时比较植物发育的不同时期以及分离某些重要基因（cDNA-AFLP）。利用cDNA-AFLP的方法，阐明了马铃薯块茎在不同发育阶段基因表达的情况，并克隆了2个与块茎脂肪氧合酶高度同源的cDNA片段（Bachem等1996）。在植物育种上的应用在杂交育种中，单单根据育种材料的表型特点选配亲本，往往会受到环境条件的干扰。辅之以DNA分子标记的差异性分析，将使得亲本选配更为快速、准确，从而提高育种效率。揭示育种材料之间的亲缘关系杂种优势利用正成为许多作物提高产量和改善品质的重要途径。对遗传差异与杂种优势关系的评价方法经历了从形态性状遗传距离，到生化标记遗传差异，亲缘系数，以及分子标记遗传差异等各种尝试。杂种优势预测及机理研究

DNA分子标记的应用，使得能够在整个基因组范围内对大量亲本材料间的遗传距离进行估测，并在此基础上有效地预测具有强优势的组合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。结果：既有相关性很高的报道，又有完全相反的结果。张启发认为：分子标记杂合度与杂种优势的相关性因遗传材料而异，在经过改良的优良种质中，两者之间高度相关，而在一些未经改良的优良种质中，相关程度很低。提出了“上位性是杂种优势的主要遗传基础”的重要观点。应用cDNA－AFLP技术进行杂种优势机理的研究表明，强优势与弱优势组合间基因表达有明显差异，有增强型、减弱型和沉默型。杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉默有密切关系。大量研究表明，虽然分子标记揭示的遗传距离与杂种优势的关系比较复杂，但亲本之间的遗传差异