生物制药综合性实验实验报告

PAGEPAGE26广东药学院基因工程（跨课程）综合性实验论文姓名班级学号指导教师广东药学院生命科学与生物制药学院生物制药研究所目录TOC\o"1-4"\f\h\z\u摘要 2前言 3一、材料与方法 41.1材料 41.1.1重组蛋白质药物单元的实验材料 41.1.2重组DNA药物单元的实验材料 41.2方法 51.2.1重组蛋白质药物单元 51.2.1.1工程菌构建（已由老师完成） 51.2.1.2 工程菌表达筛选 61.2.1.3制备IL-18工程菌甘油种 81.2.1.4GST工程菌生长曲线分析 81.2.1.5GST工程菌表达影响因素试验 91.2.1.6表达进程分析 91.2.1.7凝胶扫描分析 101.2.1.8发酵工艺（观摩） 101.2.2重组DNA药物单元 101.2.2.1质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大规模制备 101.2.2.2TCR质粒-脂质体复合物制备与分析 111.2.2.3TCR体外转染活性检测 121.2.2.4TCR转染体内试验 12二、结果与讨论 122.1重组蛋白质单元结果与讨论 132.1.1IL-18工程菌表达筛选SDS 132.1.2 GST工程菌生长曲线分析 142.1.3表达影响因素试验 152.1.4 表达进程试验 172.2重组DNA药物单元结果与讨论 192.2.1质粒阴离子交换层析纯化 192.2.2质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析 202.2.3质粒-脂质体复合物制备 212.2.4TCR转染基因表达荧光检测 212.2.5TCR体外转染活性检测 232.2.6TCR转染体内试验 25三、小结 27致谢 27

摘要：本综合性实验分为“重组蛋白质类药物”和“重组DNA类药物”二个单元。重组蛋白质药物以hIL-18的大肠杆菌表达系统为例，全面介绍工程菌构建、表达筛选、甘油种制备、生长与表达分析、发酵工艺单元操作和表达产物分离纯化等基因工程药物研发与生产实践中最常用的技术与工艺过程。“重组DNA药物”单元以质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP为例，介绍质粒DNA大规模制备、阳离子脂质体与质粒DNA复合物制备、T细胞体外转染、转染T细胞目的基因表达和体外活性检测、体内给药试验等。关键词重组蛋白药物;hIL-18;重组DNA药物;阳离子脂质体与质粒DNA复合物Abtract：Thecomprehensiveexperimentsaredividedintotwounits,whichis"RecombinantProteinDrugs"and"RecombinantDNADrugs".Theunit,Recombinantproteindrugs,takesexampleforhIL-18inE.coliexpressionsystem.ItcomprehensivelyintroductedthemostusualtechnologyandprocessofR&Dandproductionpracticeofthegeneticengineeringdrugs,suchastheconstructionofengineeringbacteria,expressionscreening,glycerolkindofpreparation,growthandExpressionAnalysis,fermentationprocessunitoperationandthepurificationofexpressionproduct.Theunitof"RecombinantDNAdrug"takedplasmidTCRVα12.2-Vβ7.1-EYFPasexample.Itintroductedthelarge-scalepreparationofplasmidDNA,Preparationofcationicliposomes-plasmidDNAcomplex,invitroTransfectionofTcells,expressionandinvitroactivityassayingofthetargetgeneoftransfectedTcellsandundertakingthetestinvivo.KeywordsRecombinantProteindrugs;hIL-18;RecombinantDNAdrugs;cationicliposomes-plasmidDNAcomplex

前言生命科学与生物技术的最主要任务之一是利用其理论与技术研究成果为人类的健康服务，生物技术制药则是其最主要的应用领域，且在重大传染性疾病、恶性肿瘤及其它疑难杂症防治方面具有巨大的潜力。药品的研究开发是一项庞大的系统工程，实验室研究发现的任何候选药物要开发成新药都需要经过生产工艺和质量控制研究、有效性评价和安全性评价等过程。需要特别指出的是，生产工艺和质量控制研究的内容和任务还会始终贯穿于产品投产上市的过程中，相应的技术手段也是作为企业生产或质量控制人员必备的技能。因此，作为生命科学与生物制药学院的本科生，了解生物技术药物研究、开发和生产的过程、掌握与生产工艺和质量控制研究密切相关的技术手段是非常必要的。以蛋白质为基础的基因工程药物和基因工程抗体是当今最主要的生物技术药物形式，以DNA为基础的基因治疗制剂和DNA疫苗是未来生物制药的主要发展方向之一。一、材料与方法1.1材料1.1.1重组蛋白质药物单元的实验材料1.1.1.1仪器超净工作台、移液枪（量程：10—100，0—1000）、灭菌枪头、标记笔、无菌牙签、带塞试管、恒温摇床、恒温培养箱、带塞三角瓶（500mL）、EP管(1.5mL)、可见分光光度计、电泳仪、垂直电泳装置、水浴锅、离心机、台式高速离心机、培养皿、冰箱（-20℃，-80℃，1.1.1.2氨苄青霉素、LB培养基、pBV220—hIL-18转化平板、GST工程菌平板、2×上样缓冲液、10×电泳缓冲液、10%APS、30%胶母液、10%SDS、TEMED、分离胶缓冲液（pH8.8）、浓缩胶缓冲液（pH6.8）、考马斯亮蓝染色液、脱色液、10%甘油、去离子水、IPTG1.1.2重组DNA药物单元的实验材料1.1.2.1高速冷冻离心机、台式高速离心机、离心机、离心杯、离心管、水浴锅、4℃冰箱、超净工作台、移液枪、灭菌枪头、500mL三角瓶、常压层析系统、烧杯、水平电泳装置、电泳仪、紫外检测仪、凝胶成像系统、紫外分光光度计、1.5mLEP管、恒温培养箱、灭菌玻璃滴管、12孔培养板、细胞计数板、电子显微镜、1.1.2.2STE、碱裂解溶液Ⅰ（（高压灭菌）：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris－Cl（pH8.0））、碱裂解溶液Ⅱ（0.2MNaOH、1％（m/V）SDS（高压灭菌））、碱裂解溶液Ⅲ（5mol/L乙酸钾、冰乙酸、H2O）、异丙醇、70%乙醇、TE、0.02MNaCl的TE溶液、0.3MNaCl的TE溶液、1.0MNaCl的TE溶液、0.5MNaOH、RNA酶、双蒸水、生理盐水、1.0MnaCl、20%乙醇、琼脂糖、TAE、EB、电泳缓冲液、Marker、Buffer、质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP、脂质体、肿瘤细胞BEL-7402、胰酶、完全培养基、4%苯酚溶液、1640培养基、胎牛血清、IL-2、双抗（青霉素、链霉素）1.2方法1.2.1重组蛋白质药物单元1.2.1.1工程菌构建（已由老师完成）（1）pBV220-hIL-18表达载体和工程菌构建在本综合性实验中目的基因的表达载体为pBV220，该载体的物理图谱见图1。该载体有一个氨苄青霉素抗性基因，在多克隆位点的上游为λ噬菌体的PL和PR启动子，PL和PR启动子受λ噬菌体CI基因的负调控。CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白，在28-37℃培养时，CI产生抑制作用，在温度升至42℃时，CI被破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使PL和P目的基因为hIL-18的编码序列（cDNA），采用RT-PCR技术从外周血细胞中获得。首先据Genebank报道序列设计引物，并在引物的5’端引入EcoRI位点和启始密码子ATG，在3’端引入HindⅢ位点。IL-18基因的RT-PCR扩增产物经EcoRI和HindⅢ双酶切插入表达载体pBV220的相同位点即得hIL-18的表达载体pBV220-hIL-18。构建的表达载体pBV220-hIL-18按常规方法转化大肠杆菌DH5α株后即得“重组hIL图1pBV220物理图谱（2）pGEX-GST表达载体和工程菌构建pGEX-GST为商品化融合表达载体，主要用于外源基因的可溶性融合表达。GST（谷胱甘肽转移酶）为大肠杆菌宿主细胞的天然高效、可溶性表达的蛋白。以其作为融合表达“标签”有二点优势：a)GST可以促进二硫键的形成，使目的基因融合表达产物能正确折叠，因而常以可溶的表达产物存在；b)GST属于大肠杆菌高效表达的天然产物，其mRNA的5‘端具有最适的结构，有利于融合基因mRNA的翻译，因此可大大提高融合基因表达水平。在pGEX-GST中，GST处于复合启动子Tac的控制之下，因此可采用IPTG诱导。其载体如图2所示，图中所示载体中还有一个特殊设计，即GST与目的蛋白的融合位点位PreScission蛋白酶识别位点，融合蛋白可在4℃下进行酶切反应，可避免其它蛋白酶类37℃那样的高温条件对目的产物的破坏。本综合实验中采取的是无外源基因的载体，即只表达GST，主要用于给同学们展示与pVB220-hIL-18不同的另一种启动子和表达诱导方式（PL/PRvsTac；温控vsIPTG诱导），并便于“表达进程分析图2pGEX-GST的物理图谱工程菌表达筛选（1）菌种活化在无菌操作条件下，用无菌竹签随机挑取中等大小菌落的克隆，先在含有100ug/mL氨苄青霉素的LB平板上轻轻点一下，不要插入平板，随后用带有残余菌体的牙签接种含有2mLLB培养基（含100ug/mL氨苄青霉素）的带塞试管，如此类推。每个学生接种1株，第1位同学负责接种对照，共接种7个转化子单克隆，每个小组共用一个平板；将GST工程菌接种到含有2mLLB培养基（Amp+）的试管中。及时、准确做好划线平板与试管的对应编号和平板编号标记。平板和试管种分别置于37℃培养箱和摇床37℃，160rmp培养过夜。（2）IL-18工程菌表达诱导将前一天摇床过夜的6支试管的IL-18菌液按1%（即30ul）的接种比例分别接种到6支含有3mLLB培养基（含75ug/mL氨苄青霉素）的试管中，37℃摇床170rmp培养2.5hr，迅速转移到42℃培养箱中诱导培养4hr。每个小组设一非诱导对照，标记为CK1，CK1于37℃培养6.5hr，不做42℃表达诱导。培养完后，从试管中取300ul于EP管中，(3)IL-18工程菌表达筛选SDS（1）菌体样品处理取-20℃冻存的培养物EP管，置于离心机5000g×5min离心，弃上清，菌体加入40ul2×上样缓冲液，封口膜封好EP管，100℃水浴3min(Marker同时一样处理)，待冷却后10000g×10min离心，小心吸取上清，转入另一标记好的EP管，室温保存备用（如长期放置，则置于4（2）SDS、配制适量的12％的分离胶：H2O3.3mL、30％胶母液4.0mL、分离胶缓冲液（pH8.8）2.5mL、10％SDS0.1mL、10％APS0.1mL、TEMED0.008mL。2、将配制好的分离胶加入制胶槽中，注意应沿着边缘缓慢加入，千万别进气泡。凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm处。3、轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水封胶，使凝胶表面变的平整，静置47min，使凝胶聚合。凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面，可以微微倾斜模具，检测凝胶是否聚合。4、除去上面的水层，再用滤纸吸尽残留的液体。5、配制5％的浓缩胶：H2O3.4mL、30％胶母液0.83mL、浓缩胶缓冲液（pH6.8）0.63mL、10％SDS0.05mL、10％APS0.05mL、TEMED0.005mL。6、迅速将配好的浓缩胶添加到分离胶上面，并将梳子插入凝胶内，至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐，小心避免混入气泡。将凝胶垂直放置于室温下，约25min凝胶聚合。7、将胶板放入电泳槽中，在上下电泳槽中添加电泳缓冲液，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。轻轻拔出梳子，注意不要将加样孔撕破。8、在电泳槽的泳道中分别添加蛋白Marker10ul和样品10ul。每小组共用一胶，每胶15孔，1号孔为蛋白质分子量标准Marker，2-7号孔为自小至大编号的菌株诱导菌体蛋白，8号孔为非诱导菌体蛋白（对照CK1）。加样时用微量移液器将样品加入样品孔的底部，避免带入气泡。9、接通电源，上槽（加样孔端）接负极，下操接正极，恒流，起始电流20mA，待溴酚篮前沿进入分离胶，电流增加至30mA。10、待蓝色前沿跑至距电泳槽底部0.5cm时，切断电源，从电极上拔掉电极插头，取出玻璃板。11、带上手套，小心移去两玻璃之间的隔片，利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板，小心从制胶板上将凝胶剥下，弃去浓缩胶。在右下角切去小片作为定位标记。12、用清水洗胶，将分离胶放入染色液于摇床中40℃13、从染色液中将凝胶取出用水漂洗后，将胶放入脱色液中进行扩散脱色3次，直到背景蓝色褪淡，见到条带。倒掉脱色液，加入10%甘油保存至凝胶扫描分析。（4）工程菌表达筛选观察电泳结果，找出表达量高的条带，对应前面在平板上的划线，挑选高表达的菌落，接种到2mLLB(Amp+)液体培养基中。接种GST工程菌到3管2mLLB(Amp+)液体培养基中，标记好放到摇床中37℃1.2.1.3制备IL-18工程菌甘油种取5个EP管，按1：1（V/V）的比例加入250ul无菌的60％甘油和250ul接种的高表达的IL-18工程菌液，混匀后-80℃冰箱保存。1.2.1.4GST工程菌生长曲线分析在超净工作台将过夜培养的GST工程菌种子液按5%的接种量（1mL），接入到19mLLB(Amp+)的三角瓶中。摇匀后取出1.5mL于EP管，用于0小时的OD值测定。将三角瓶置于摇床中37℃，170rpm振摇培养。此时开始计时，然后每培养1小时将三角瓶取出置于超净工作台中，取样测定其OD600值，共测定6小时。其中，前2小时每次取样1.5mL，之后每次取样0.5mL，用LB培养基稀释至1.5ml生物量测定时，先将光分光光度计调节波长至600nm，预热30min，取1.5mL未接种的LB(Amp+)培养基于比色杯中作为空白对照，将菌液加至比色杯中进行测定。记录读数。将测定的OD值填入下表：时间0h1h2h3h4h5h6hOD600以上述表格中的时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制GST工程菌的生长曲线。1.2.1.5GST工程菌表达影响因素试验（1）诱导时机的影响按5%的接种量，将3管过夜培养的GST工程菌种子液混在一起，分别取1mL接入到含19mLLB的三角瓶（标记为A1-1、A1-2、A1-3）中，三角瓶中应先加入氨苄青霉素，三支瓶分别取1.5ml测生物量(OD600,0h)，然后置于摇床中37℃，170rpm振摇培养。培养至1.5h时，取出A1-1，在超净工作台中取出1.5mL测其生物量（OD600,诱导前）。然后加入2ulIPTG继续培养进行诱导表达。当培养至2.5h时，再取出A1-2，取出1.5mL测生物量，加入2ulIPTG继续培养进行诱导表达。当培养至3.5h时，取出A1-3，操作。三瓶菌体均诱导表达4h。分别培养4h后，将三角瓶从摇床取出，在超净台上取1ml于EP管中，-20℃冻存备用（2）表达因素实验SDS取前一天-20℃冻存的6支样品EP管，置于离心机5000g×5min离心，弃上清，加入40ul2×上样缓冲液，封口膜封好EP管，100℃水浴3min(Marker同时一样处理)，待冷却后10000g×10min离心，小心吸取上清，转入另一标记好的EP管，室温保存备用。进行SDS电泳（操作同之前）1.2.1.6表达进程分析（1）GST工程菌表达进程实验接种在超净台中GST平板上挑选一菌落接种于含2mLLB(Amp+)液体培养基中，同一菌落接种3管，置于摇床中37℃，170rpm振摇培养过夜（2）诱导表达并取样进行表达进程分析从摇床中取出接种了GST工程菌的3支试管，在超净台上将3支试管的菌液混于一支试管中，共有6mL，取出5mL加到含100mLLB(Amp+)的三角瓶中，置于摇床中37℃，150rpm振摇培养。培养2.5h后，取出三角瓶，取1ml于EP管-20℃冻存。往三角瓶中加入100ulIPTG，诱导培养5h。此后每隔1小时取样1ml于EP管（3）表达进程分析SDS如前面操作。上样量为10uL。1.2.1.7凝胶扫描分析将三次的SDS电泳胶进行凝胶扫描。1.2.1.8发酵工艺（观摩）1.2.2重组DNA药物单元1.2.2.1质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大规模制备（1）培养细菌使质粒扩增500mL菌液接种于200mlLB培养基,用前按1：1000比例加入卡那霉素溶液（50mg/ml）,37℃（2）碱法大量提取质粒DNA将装在500mL三角瓶的200mL菌液转移到离心杯中，3500rpm离心5min，弃去上清培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。加入5mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬沉淀。向离心管中加入10mL新鲜配制的溶液Ⅱ，轻轻颠倒离心管5次。将离心管静置5min。后向离心管中加7.5mL冰预冷的溶液Ⅲ，缓慢颠倒4-5次使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将离心管置冰上5min，12000g，离心15min，取上清。加0.9倍体积的异丙醇，冰上放置10min。12000g，离心20min，弃上清。加10mL70％乙醇，12000g离心10min，弃上清，沉淀在空气中干燥。以8mLTE（含20μg/ml的RNaseA）溶解沉淀，37℃水浴锅中保温2hr后取出置于4（3）离子柱层析纯化质粒DNA①装柱：先用1-2倍柱体积（20mL）双蒸水洗柱。②平衡：20mL含0.02MNaCl的TE溶液平衡。③上样：取冻存的质粒溶液取1mL留样用于后面的电泳，余液以TE（pH8.0）稀释至50mL，用恒流泵泵入柱中。走纸速度为12cm/h,灵敏度为0.1A，电压200V,A=280nm。④冲平：待样品上完，用0.02MNaCl的TE溶液洗柱至基线。⑤洗脱：用0.3MNaCl的TE溶液洗柱至基线平衡（去处杂蛋白及其它小分子物质），后改用1MNaCl洗柱至基线平衡（洗脱质粒DNA），再用0.5MNaOH洗柱至基线平衡，接着用水洗至中性。在洗脱过程中用离心管收集各吸收峰，并用EP管收集峰尖留样并标记。⑥再生：用1.0MNaCl过柱。20%乙醇中保存。（4）琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒DNA称取0.8g琼脂糖于三角瓶中，用量筒量取80mLTAE倒入三角瓶。加热溶解，待冷却到60℃再加入5uLEB。将琼脂糖溶液慢慢倒在插有梳子的胶膜上，厚约3mm1.2.2.2TCR质粒-脂质体复合物制备与分析（1）质粒-脂质体复合物制备：包封率的测定吸取质粒DNA2ug(10ul)+NaCl40ul=50ul=1\*GB3①10min吸取脂质体5ul+NaCl45ul=50ul=2\*GB3②10min对照质粒DNA2ug(10ul)＋NaCl90ul=100ul(B)10min将=2\*GB3②加入=1\*GB3①，室温放置20min，(A)。超速离心，12000rpm10min，分别取每管上清50ul测紫外吸光度OD260值，生理盐水50ul作为空白对照。计算包封率：包封率（%）＝（ODB－ODA）／ODB×100％（2）质粒-脂质体复合物制备：转染用吸取质粒DNA12ug(60ul)吸取脂质体30ul1640培养基210ul将上述溶液轻轻混匀，室温放置15min。转染用50ul/孔，共转6孔。1.2.2.3PBMC体外基因转染（1）人T淋巴细胞（PBMC）由老师完成。（2）用含TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的质粒转染人淋巴细胞取一12孔板，每孔加入1mL淋巴细胞悬液，细胞总数为1×106个。共接种12孔，其中6孔用于转染，6孔作为对照。向转染用的6孔中加入50ul/孔的质粒-脂质体复合物，混匀，放入培养箱中5h后每孔分别加入800ul培养基+200ul胎牛血清+2ulIL-2+20ul双抗，继续培养24h。（3）转染T淋巴细胞基因表达荧光检测将以上培养的12孔板培养48h后置于荧光显微镜下拍照，然后用于Bel-7402细胞共孵育，以及小鼠体内实验。1.2.2.3TCR体外转染活性检测（1）肿瘤细胞BEL-7402接种，培养取肿瘤细胞BEL-7402一瓶，弃去培养基，用移液器吸取灭菌生理盐水2mL加入培养瓶中，轻轻洗涤细胞一次，弃上清。向瓶中加入1mL胰酶，盖紧瓶盖，室温消化3分钟，盖紧盖子在显微镜下观察细胞状态。待细胞变圆成单个细胞后，竖起培养瓶，在操作台上打开瓶盖，倒去胰酶液体。向瓶中加入4mL1640培养基，用玻璃滴管吹打，取800ul悬液于EP管中用于细胞计数，计数结果为8.5×105个/mL。取一支离心管，加入750ul细胞悬液，600ulFBS,4650ul1640培养基，6ul双抗，混匀之后将肿瘤细胞悬液接种于12孔板，1mL/孔，加6孔。将培养板置于细胞培养箱中，37℃培养（2）T细胞-肿瘤细胞共孵育分别吸取2孔已转染T淋巴细胞，1800rpm,5min离心，弃上清，用1640培养基1ml吹打混匀，加入Bel-7402培养板（先吸去培养液，加入16401ml）中，1ml/孔，每孔补加10%血清和双抗（1：1000）；再吸取2孔未转染的T淋巴细胞，也按上面方法处理，余下2孔肿瘤细胞作为对照。将培养板置于细胞培养箱中，37℃培养24小时后置于倒置显微镜下进行拍照1.2.2.4TCR转染体内试验（1）荷瘤昆明小鼠模型建立（提前一周）取8只小鼠(雌雄分开养)，用苦味酸标记。1-7号腹腔注射0.3mLH22细胞液（107个cell/ml），8号腹腔注射0.3mL生理盐水。将8只小鼠置于实验室培养，观察小鼠的腹水生成情况。（2）转染T细胞注射荷瘤小鼠转染T淋巴细胞剩余4孔分别离心1800rpm,5min，分别加入0.2ml生理盐水，腹腔注射小鼠体内，未转染的2孔细胞也按上述处理作为对照，其余小鼠注射0.2ml生理盐水作为阴性对照。连续一周观察小鼠的腹水生成情况，这期间要每天给小鼠喂食，保持小鼠饲养环境的清洁，最后进行拍照比较。二、结果与讨论2.1重组蛋白质单元结果与讨论2.1.1图1.1IL-18工程菌表达筛选SDS凝胶扫描图图1.2工程菌表达筛选BandScan分析图泳道1-6对应1-6号菌株，泳道7为对照菌株CK1每个泳道的上样量为10ul，目的蛋白的分子量为28KD，由图1.1可以看出，1-5泳道均有表达，6、7泳道没有相应的条带。7号为对照组，其菌液始终在37℃下培养，没有进行42℃的诱导，故无目的蛋白产生。而6号无条带属于异常现象，可能是转化时只转入了空质粒。经BandScan软件进行数据分析（图1.2），2号菌株表达量最高（14.9%），1号菌株为12.1%，4号菌株12.3%，3号菌株7.0%，5号菌株4.6%。但是从条带上可以看出，2号菌蛋白表达总量比较少，1号菌的表达总量相对是最好的。使用软件我们发现，跑胶的质量直接影响到软件分析的可靠性，我们组的胶跑得不是很好，条带不太清晰，所以软件分析结果参考价值并不是很大。通过目测，本组选择3号菌株作为高表达菌株保种。GST工程菌生长曲线分析依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。表1.1GST工程菌生长OD值时间0h1h2h3h4h5h6hOD6000.0800.2640.7281.2511.6381.8961.959图1.3GST工程菌生长曲线由图1.3可看到，该生长曲线呈S形，经过了延缓期、对数期到稳定期的趋势。0-1h生长较缓慢，从第1h开始呈对数增长，到5h以后生长趋于稳定。对数中期确定第3个小时。2.1.3表达影响因素试验基因工程菌的培养一般分两段。前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。加入诱导因子的时间被称为诱导时机。对于基因工程菌一般选择其对数生长期作为菌体的诱导时机。如表1.2所示：如果在对数生长早期进行诱导，由于菌体量较少，蛋白的表达量不高。在对数生长中期进行诱导，工程菌的生长速度比较快，这时蛋白的积累加快，蛋白表达水平较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。在此状态下诱导，表达显然受到影响。表1.2诱导时机OD值1.5小时2.5小时3.5小时0小时0.0560.0500.046诱导前0.4660.7441.149图1.4诱导时机对工程菌表达SDS凝胶扫描图1、2:培养1.5h后IPTG诱导4h3、4:培养2.5h后IPTG诱导4h5、6：培养3.5h后IPTG诱导4h每个泳道的上样量均为10ul，图1.4可以看出，表达量最高的是4号泳道，3号泳道的总蛋白量比4号泳道少，所以目的蛋白较少，但比例差不多。其次是1号和2号泳道，最少的是5号和6号泳道。从图1.5可看出，2-7泳道都有目的蛋白表达，5号泳道的目的蛋白表达量最高，2号泳道的目的蛋白表达量高于6泳道。所以在GST培养1.5h—2.5h时对工程菌进行诱导得到的目的蛋白含量最高。图1.5诱导时机对工程菌表达的影响BandScan分析图表达进程试验诱导时间是指加入诱导剂后的培养时间。随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加，但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。由上述实验选择了培养2.5小时作为诱导时机。图1.6所示，1号泳道有少量蛋白表达（28KD），因为还没有开始诱导，应该属于本底表达；之后的泳道诱导时间逐渐增加，相应的目的蛋白的条带颜色也在加深，蛋白总的表达量也在增加，但是目的蛋白的含量未见明显增加。软件的分析也表明了这一点。因此，虽然诱导时间的延长有助于总蛋白量的增加，但如果目的蛋白的增加不多的话，考虑到成本和经济效益，应该选择一个合适的诱导时间。图1.6GST表达进程SDS凝胶扫描图1：培养2.5h的样品2:IPTG诱导1h的样品3：IPTG诱导2h的样品4：IPTG诱导3h的样品5：IPTG诱导4h的样品6：IPTG诱导5h的样品图1.7GST表达进程BandScan分析图2.2重组DNA药物单元结果与讨论2.2.1质粒阴离子交换层析纯化如图2.1所示，A1-2和A1-2-2为穿透峰，A1-3、A1-4、A1-5分别为用含0.3mol/LNaCl的TE、含1.0MNaCl的TE、1.0MNaOH的洗脱峰。上样后用平衡缓冲液过柱后，除去大量的杂质，产生穿透峰。洗脱峰A1-3是用0.3MNaCl的TE溶液洗柱产生的，除去与柱子结合不太紧密或者一些非特异性结合的物质。洗脱峰A1-4是用1MNaCl洗柱产生的，可洗脱质粒DNA，洗脱峰A1-5是用1.0MNaOH洗脱的，可除去与柱子结合得比较紧密的物质。图2.1阴离子交换纯化层析图2.2.2质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，可作为电泳支持物，适用于分离大小范围在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的迁移率与分子量的对数值成反比关系。观察其迁移距离，与标准DNA片段进行对照，就可获知该样品分子量大小。在质粒抽提过程中，由于各种因素的影响，使质粒DNA呈现超螺旋的共价闭合环状、开环状分子、线状分子三种不同的构型，这三种分子有不同的迁移率。在一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的为开环状分子。用荧光染料溴化乙锭（ethidiumbromide,EB）进行检测，溴化乙锭嵌入碱基对之间形成荧光络合物，在紫外线激发下发出红色荧光。如图2.2所示，原样是纯化前样品，有若干明显的条带，是不同构型的质粒和一些DNA杂质。泳道1、2的样品主要是一些杂蛋白，不含DNA，故无条带；泳道3中有一条比较模糊的条带，对应于质粒的开环构型；泳道4洗脱峰为质粒，条带比较模糊，可能是洗脱不彻底，而泳道5中出现明显的条带，与原样的组成相似，说明在用1MNaCl过柱时，并不能很好的将质粒洗脱下来，同时也解释了泳道4中出现的现象。可以考虑用更高的盐浓度来洗脱。图2.2质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析原样：上柱前样品1、2：0.02mol/LNaCl洗脱峰样品3：0.3