酶工程酶的生产和纯化

Chapter2

Theproduction&PurificationofEnzyme酶的生产和纯化第一页，共八十四页。合适的酶源？一级生物？足够酶产量？细胞是否稳定？易于后处理？成本高低？纯化能否成功？筛选新酶源有机体中转入新基因传统/基因技术提高产量改进发酵条件改进后处理：减少费用和浪费；提高纯度更具竞争力、更廉价的目标酶第二页，共八十四页。Contentsofchapter22.2酶的生产及提高酶产量的措施2.3酶的下游处理GoGoGo2.1酶源第三页，共八十四页。2.1酶源第四页，共八十四页。动植物组织动植物细胞野生微生物重组微生物Enzymesource12%88%第五页，共八十四页。-淀粉酶(曲霉)葡萄糖淀粉酶(曲霉，根霉)果胶酶/果胶裂合酶(曲霉)乳糖酶(曲霉，克鲁维酵母)蔗糖酶/葡聚糖酶(酵母)微生物凝乳酶(毛霉)葡聚糖酶(青霉)/-淀粉酶(芽孢杆菌)青霉素酰胺酶(芽孢杆菌)支链淀粉酶(克雷伯菌/芽孢杆菌)木糖异构酶(芽孢杆菌/链霉菌)天冬酰胺酶(大肠杆菌)DNA连接酶(大肠杆菌)过氧化氢酶(肝脏)胰蛋白酶(胰脏)胰凝乳蛋白酶(胰脏)三脂酰甘油脂肪酶(胰脏)凝乳酶（胃）猕猴桃蛋白酶/-淀粉酶(麦芽)脂肪加氧酶(大豆)-葡聚糖酶(麦芽)无花果蛋白酶工业酶生产所用的原料细菌真菌植物动物第六页，共八十四页。微生物产酶之优点

微生物种类繁多产酶种类齐全生长周期短繁殖快不受季节气候限制培养基来源丰富产酶成本低易变异，用遗传技术培育高产理想菌株培养简便易行易管理、工厂化生产第七页，共八十四页。安全无毒，非致病菌周期短，产量高遗传性能稳定，不易退化易于酶分离纯化易培养，廉价易得产酶菌种的要求新产酶菌种需毒理和动物实验，食品和医药酶需经有关部门批准。第八页，共八十四页。一般产胞内酶主要的酶品种谷氨酸脱羧酶、天冬氨酸酶、青霉素酰化酶等基因工程操作酶：限制性内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等大肠杆菌（E.coli）第九页，共八十四页。能产生多种胞外酶主要酶品种淀粉酶类：如-淀粉酶（胞外）蛋白酶类：如中性蛋白酶（胞外）磷酸酶类：碱性磷酸酶（细胞间质）、5’-核苷酸酶等枯草杆菌（B.subtilis）第十页，共八十四页。链霉菌（Streptomyces）主要酶品种葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、几丁质酶、碱性/中性蛋白酶等含有丰富的16-羟化酶，用于甾体转化第十一页，共八十四页。黑曲霉（Aspergillusniger）可生产多种酶（胞内酶或胞外酶）主要酶品种糖化酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶等第十二页，共八十四页。广泛应用于酿造和食品行业主要酶品种糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、植酸酶、果胶酶、氨基酰化酶、磷酸二酯酶、核酸酶等米曲霉（Aspergillusoryzae）第十三页，共八十四页。菌落成熟后产红色色素，颜色较深腐生真菌，能耐受pH3.5和10%酒精，尤嗜乳酸主要酶品种-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、麦芽糖酶、酯酶等红曲霉属（Monascus）第十四页，共八十四页。腐生真菌，存在于空气中及腐烂的物质表面主要菌种和酶的种类产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）葡萄糖氧化酶、纤维素酶、果胶酶、青霉素酰化酶等橘青霉（Penicilliumcitrinum）脂肪酶、葡萄糖氧化酶、5’-磷酸二酯酶、核酸酶等青霉属（Penicillium）第十五页，共八十四页。青霉属（Penicillium）第十六页，共八十四页。主要酶种类纤维素酶亦用于生产17-羟化酶，用于甾体转化木霉（Trichoderma）绿色木霉(T.viride)的菌落哈茨木霉(T.harzianum)的显微形态第十七页，共八十四页。主要产酶品种糖化酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等具有11-羟化酶，用于甾体药物转化根霉（Rhizopus）第十八页，共八十四页。能糖化淀粉，能分解大豆蛋白，多用来做豆腐乳、豆豉主要产酶品种蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等毛霉（Mucor）第十九页，共八十四页。广泛应用于食品工业，细胞呈圆形、卵形、椭圆形，在麦芽汁培养基上菌落白色有光泽主要产酶品种醇脱氢酶、丙酮酸脱羧酶、转化酶等啤酒酵母（Saccharomycescerevisiae）第二十页，共八十四页。细胞呈圆形、卵形或长形，出芽成假菌丝，在麦芽汁琼脂培养基上菌落乳白色或奶油色主要产酶品种脂肪酶、尿酸酶、转化酶、醇脱氢酶、17-羟化酶、具烷类代谢的酶系等假丝酵母属（Candida）第二十一页，共八十四页。美国食品加工酶及菌种数目中国食品加工酶及菌种数目第二十二页，共八十四页。Howto

Screen

NewEnzymes？采样产酶菌种筛选产酶菌种改良富集培养，菌种分离第二十三页，共八十四页。为获得降解某种物质的产酶菌种，通常在该物质较丰富的地方寻找。a.采样第二十四页，共八十四页。木质素酶or纤维素酶

尿酸酶污染物降解酶

第二十五页，共八十四页。嗜热酶thermophilicenzyme

嗜冷酶psychrophilicenzyme

嗜酸/嗜碱酶acidphilic/alkaliphilicenzyme

嗜盐酶halophilicenzyme

极端酶第二十六页，共八十四页。b.产酶菌种筛选对分离出的菌种做产酶能力检测，选出理想产酶菌株，包括初筛和复筛两个阶段。初筛：挑出产目的酶的菌株，方法快速、简便，多采用平板培养透明圈法。复筛：筛选产酶量高、性能更符合要求的菌株，方法更准确，培养方式更符合工业生产，摇瓶/固体培养。第二十七页，共八十四页。以淀粉为碳源，在含KI-I2的淀粉培养基上，菌落周围因分泌出的-淀粉酶将淀粉水解而导致蓝色消失，生成“水解圈”。例：-淀粉酶生产菌的筛选第二十八页，共八十四页。在培养基中添加酪蛋白，经蛋白酶的水解，培养基相应位置变为澄清的“水解圈”。例：蛋白酶生产菌的筛选第二十九页，共八十四页。c.产酶菌种改良原菌株细胞或孢子悬浮液制备诱变剂处理中间培养初筛复筛突变株分离生产性实验诱变育种目的基因获取基因表达载体构建目的基因导入受体细胞目的基因检测与鉴定基因工程育种第三十页，共八十四页。23145案例：纤维素酶高产菌诱变育种出发菌株选择菌悬液的制备斜面培养基30℃2-4d;斜面孢子摇瓶振20min;过滤稀释至105-107个/mL菌悬液出发菌株黑曲霉LH24纤维素酶活力平均12030U/g紫外线诱变处理5mL菌悬液紫外灯30W距30cm,照射1min，打开培养皿照射5min，暗冷藏1-2h诱变菌液于培养基平板,筛出生长良好菌株发酵,得9株高产株,产酶量14000U/g初筛复筛初筛菌株接种到培养液,3h后测酶活复筛，得3株产酶量>16000U/g

4第三十一页，共八十四页。案例：高产N-乙酰神经氨酸裂合酶的基因工程育种12345按nanA基因设计合成引物;PCR扩增nanA基因酶切PCR产物和质粒;连接转化培养;凝胶电泳重组质粒构建PCR扩增基因基因诱导表达将阳性克隆培养;接种于LB培养基;诱导表达离心收集菌体;取上清SDS–PAGE电泳;酶表达量凝胶电泳分析NPL活力测定酶促反应;580nm测吸光度;工程菌酶活提高第三十二页，共八十四页。d.富集培养，菌种分离菌种分离：自然条件下各类微生物混杂，须分离获得纯种。通常采用平板划线法和反复稀释法。

富集培养：通常样品中所需菌很少，需使所需菌大量生长，不需菌少或不生长，以利于筛选。可控制温度、pH，或用底物作营养成分，使所需菌快速生长。第三十三页，共八十四页。2.2酶的生产及提高酶产量的措施第三十四页，共八十四页。HOW

AREINDUSTRIALENZYMESMADE？第三十五页，共八十四页。SeedfermenterAirpetridishflaskFood&NutrientsCellRomovalCellstoCompostingConcentrationPurificaitonModificationpreservativesBlendingDrying

HeatLiquids

PowdersShiptocustomersAirLargefermenterRefinningProductionDownstream第三十六页，共八十四页。案例：枯草杆菌液态发酵产纳豆激酶菌种斜面摇瓶培养种子罐发酵罐发酵液低温离心超滤浓缩低温沉淀离心真空抽干粉碎成品碳源：麦芽糖,木糖,蔗糖(1.5-4%)或麦芽汁+酵母膏(0.1-2%)氮源：大豆蛋白胨、豆饼粉(2-5%质量比)或豆浆无机盐：

KH2PO4

(0.1%),K2HPO4

(0.3%),MgSO4

(0.05%),

CaCl2

(0.02%)发酵罐：通气量/min1:0.5~1:1(V/V),搅拌200-400r/min，罐温36.5-37.5℃,罐压第三十七页，共八十四页。WhatFactorsAffectEnzymeProduction？第三十八页，共八十四页。CulturemediumpHTemperatureDissolvedO2

etc.Fermentationprocess

Biosynthesisprocess

第三十九页，共八十四页。2.2.1酶生物合成的调节蛋白质的生物合成——翻译中的生物调节RNA的生物合成——转录中的生物调节（基因调节）第四十页，共八十四页。第四十一页，共八十四页。a.大肠杆菌生产——半乳糖苷酶，-半乳糖苷酶，硫代半乳糖苷转乙酰酶E.Coligrwonin

glucosemedium，E.Coli

grwonin

lactosemedium，

b.大肠杆菌生产——色氨酸合成酶E.Coligrwonin

glucosemedium，E.Coli

grwonin

glucosemediumadding

tryptophan，Why？

c.大肠杆菌生长E.Coligrwonin

glucoseandlactosemedium———“biphasicgrowth”葡萄糖耗尽后才利用乳糖，两个对数生长期第四十二页，共八十四页。调节基因操纵基因乳糖结构基因PLacZLacYLacamRNA

阻遏蛋白（有活性）基因关闭启动子ORPLacZLacYLaca调节基因操纵基因乳糖结构基因启动子ORmRNAZmRNAYmRNAa

阻遏蛋白（无活性）基因表达mRNAa.酶的诱导：乳糖操纵子乳糖酶的诱导

乳糖

阻遏蛋白（有活性）-Galactosidase，permease，acetylase第四十三页，共八十四页。调节基因操纵基因结构基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达调节基因操纵基因结构基因辅阻遏物trp代谢产物与阻遏蛋白结合，使构象变化，与操纵基因结合，结构基因不能表达b.酶的反馈阻遏：色氨酸操纵子第四十四页，共八十四页。c.酶的分解代谢物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基因表达CAP基因结构基因TCAPOCAP结合部位RNA聚合酶TcAMP-CAPP葡萄糖分解代谢产物腺苷酸环化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5'-AMP抑制激活葡萄糖降解物与cAMP的关系cAMPcAMP：环腺苷酸；CAP：环腺苷酸受体蛋白或降解物基因活化蛋白降低cAMP浓度使CAP呈失活状态第四十五页，共八十四页。酶的诱导和阻遏操纵子模型B.有活性阻遏蛋白加诱导剂A.有活性阻遏蛋白C.无活性阻遏蛋白D.无活性阻遏蛋白加辅阻遏剂第四十六页，共八十四页。调控方式阻遏蛋白添加物与操纵基因结合阻遏效应举例酶的诱导有活性－＋不转录，继而不翻译诱导物－转录，继而翻译乳糖操纵子酶的阻遏无活性－阻遏物＋不转录，继而不翻译色氨酸操纵子酶合成的诱导与阻遏操纵子模型调控作用对比第四十七页，共八十四页。3水解4蛋白质水解2阻遏作用1Addinducer2Controlrepression3ReducemRNAhydrolysis1诱导活化5形成包含体6缺少辅因子4Reduceproteases

orincreasechaperon5ReduceproteinsynthesisbyT6Increasecofactorsynthesis第四十八页，共八十四页。2.2.2酶发酵过程的控制

2.2.2.3.发酵条件对产酶的影响2.2.2.2.发酵产酶动力学2.2.2.1.酶生物合成的模式GoGoGo第四十九页，共八十四页。2.2.2.1.酶生物合成的模式微生物细胞生长曲线（四阶段）0-A调整期（延迟期）A-B生长期（对数生长期）B-C平衡期C-D衰退期总细胞浓度活细胞浓度第五十页，共八十四页。时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度时间细胞/酶浓度同步合成型延续合成型中期合成型滞后合成型酶的生物合成模式—根据酶产生与细胞生长的关系细胞浓度酶浓度第五十一页，共八十四页。酶的生物合成与细胞生长同步进行（生长偶联型）大部分组成酶和部分诱导酶属于此类。酶对应的mRNA很不稳定时间细胞/酶浓度A.同步合成型组成酶：细胞中一直存在的酶，其合成仅受遗传物质控制。在细胞中的量比较恒定，环境因素影响不大。诱导酶：在环境中有诱导物存在时而产生的酶，其合成取决于基因控制和环境影响。在细胞中含量变化很大。细胞浓度酶浓度第五十二页，共八十四页。例：米曲霉在含有单宁或没食子酸的培养基中生产单宁酶[tanaseEC3.1.1.20]细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml总细胞浓度活细胞浓度胞外酶浓度胞内酶浓度第五十三页，共八十四页。酶合成随细胞生长而开始，细胞进入平衡期后，酶能延续合成一段时间。属此类的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。酶所对应的mRNA稳定性好。时间细胞/酶浓度B.延续合成型细胞浓度酶浓度第五十四页，共八十四页。例：黑曲霉在以半乳糖醛酸或纯果胶为单一碳源的培养基中，诱导产生聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，）细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml以半乳糖醛酸为诱导物细胞浓度酶浓度第五十五页，共八十四页。酶合成在细胞生长一段时间后才开始，细胞进入平衡期后酶的合成随之停止酶合成受产物的反馈阻遏或分解代谢物阻遏作用酶所对应的mRNA稳定性较差时间细胞/酶浓度C.中期合成型细胞浓度酶浓度第五十六页，共八十四页。例：枯草杆菌碱性磷酸酶[EC3.1.3.1]受其水解产物磷酸的反馈阻遏作用细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度酶浓度第五十七页，共八十四页。当细胞生长一段时间或进入平衡期后，才开始合成并大量积累酶。许多水解酶属于此类。阻遏物延缓了酶的合成。此类酶mRNA稳定性好。时间细胞/酶浓度D.滞后合成型细胞浓度酶浓度第五十八页，共八十四页。例：黑曲霉生产羧基蛋白酶[EC3.4.23.6]细胞浓度mg/ml酶浓度U/ml细胞浓度酶浓度第五十九页，共八十四页。酶的生物合成模式总结关键因素酶对应的mRNA稳定性培养基中是否存在阻遏物延续合成型是最理想的合成模式通过基因工程、代谢工程、细胞工程等手段，筛选优良菌株，使合成模式接近延续合成型mRNA稳定性阻遏物第六十页，共八十四页。2.2.2.2.发酵产酶动力学产酶动力学主要研究细胞产酶速率以及各种环境因素对产酶速率的影响规律。宏观产酶动力学：从整个发酵系统着眼，研究群体细胞的产酶速率微观产酶动力学：从细胞内部着眼，研究细胞中酶合成速率第六十一页，共八十四页。宏观产酶动力学表明，产酶速率与细胞比生长速率

、细胞浓度以及细胞产酶模式有关。式中X——细胞浓度(g/L)

——细胞比生长速率(h-1) ——生长偶联的比产酶系数(IU/g) ——非生长偶联的比产酶速率(IU/(gh))E——酶浓度(IU/L)t——时间(h)产酶动力学方程：第六十二页，共八十四页。生长偶联型（同步/中期合成型）部分生长偶联型(滞后合成型)非生长偶联型(延续合成型)

第六十三页，共八十四页。2.2.2.3.发酵条件对产酶的影响A.细胞活化与扩大培养B.培养基C.pH值D.温度E.溶解氧第六十四页，共八十四页。A.细胞活化与扩大培养菌种保藏：短期保藏、长期保藏菌种活化：使用前接种于新鲜培养基上，培养以恢复细胞生命活动能力扩大培养：为保证发酵时有足够数量的优质细胞，活化细胞要经一级至数级扩大培养一般培养到细胞处于对数生长期为宜采用孢子接种，则应培养至孢子成熟期第六十五页，共八十四页。培养基的组成碳源、氮源、水、无机盐、生长因子……根据微生物种类和生长条件确定培养基，同种细胞用于不同的酶生产，培养基成分不一样生长、增殖、发酵、产酶等各阶段所需有区别种子培养基和发酵培养基不一样尽量减少培养基中对产酶的阻遏作用的物质B.培养基的影响第六十六页，共八十四页。pH值对发酵产酶的影响影响酶解离、电荷分布、构象和酶活、膜通透性、底物和产物的性质改变酶之间的产量比例产酶最适pH值：通常接近酶反应最适pH值，但一般不同于细胞生长的最适pH值pH的变化：随细胞生长培养基pH会发生变化pH的调控：培养基组分、比例、缓冲液、酸碱、补料C.pH值的调节和控制第六十七页，共八十四页。产酶温度产酶温度往往低于生长温度较低温度mRNA稳定性较高，延续酶的合成温度过低微生物代谢减慢，延长发酵周期温度的变化因细胞新陈代谢和热量扩散，温度不断变化温度的调节热水升温冷水降温D.温度的调节和控制第六十八页，共八十四页。KO2——

耗氧速率，指单位时间内单位体积培养液中细胞的耗氧量，(mmolO2)·h-·L-1QO2——细胞呼吸强度，指单位细胞量在单位时间内的耗氧量，(mmolO2)·h-1·(gDC)-1Ccell——细胞浓度，单位体积培养液中细胞质量，(gDC)·L-1E.溶解氧的调节控制

Kd

——溶氧速率（溶氧系数），单位体积发酵液在单位时间溶解氧的量，(mmolO2)·h-1·L-1当Kd=KO2时，培养液中溶氧量保持恒定第六十九页，共八十四页。溶氧量的调节方法通气量：增大通气量提高KdO2

分压：提高O2

分压，可增加O2

溶解度，提高Kd气液接触时间：延长接触时间，可增加O2

溶解量气液接触面积：增大接触面积能提高Kd培养液黏度：黏度大易产生泡沫，影响O2溶解第七十页，共八十四页。HowtoImproveEnzymeOutput？第七十一页，共八十四页。2.2.3.1.添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶，蔗糖甘油单棕榈酸诱导蔗糖酶的生物合成等。诱导物一般可以分为3类酶的作用底物酶的催化反应产物作用底物的类似物